基于转录组和miRNA测序分析断奶仔猪肠道上皮隐窝-绒毛轴更新的分子机理
发布时间：2021-10-23 18:12
仔猪早期断奶应激综合症是生猪规模化养殖中的一个重要事件,每年给养殖企业造成了巨大的经济损失。早期断奶能够导致仔猪肠道绒毛发生萎缩,引起消化吸收不良,引发炎症,进而诱导活性氧自由基的大量释放;最终导致肠道功能异常和肠道疾病发生。本课题组前期研究发现,断奶仔猪肠上皮细胞抗氧化能力随着分化而逐渐降低;而蛋白质组学分析揭示了隐窝-绒毛轴的差异蛋白主要表现在参与碳代谢、氨基酸和蛋白质代谢和氧化磷酸化等;表明能量代谢在小肠细胞的更新过程中发挥了重要作用。为了探究早期断奶仔猪肠道上皮隐窝-绒毛轴更新的分子机制,本研究以哺乳期21日龄（断奶0天）及断奶后第1、3、7和14天的仔猪空肠上皮绒毛顶端细胞（F1）和隐窝区域细胞（F3）为实验材料进行转录组和sRNA测序分析,获得相应的mRNA和miRNA表达数据。具体研究结果如下:（1）以21日龄哺乳仔猪F1为对照组,对断奶后不同日龄（1,3,7和14天）的F1进行转录组测序,分别检测到31、77、154和112个差异基因;GO和KEGG分析显示,差异表达基因的功能主要集中在代谢、刺激反应和免疫等生物学过程,并富集到激素合成、免疫缺陷、花生四烯酸代谢及信号转...
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：160 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１－１小肠上皮的结构和自我更新［１９］??由ＩＳＣｓ分化形成的Ｐａｎｅｔｈ细胞向下迁移至隐窝底部，而其他三??
??转录组文库构建流程如图２－１所示。首先纯化Ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ：用??Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）磁珠富集含有ｐｏｌｙＡ尾的ｍＲＮＡ；?ＤＮＡ探针杂交ｒＲＮＡ，??随后分别用ＲＮａｓｅＨ和ＤＮａｓｅ?Ｉ消化掉ＤＮＡ／ｒＲＮＡ双链和ＤＮＡ探针。??然后对获得的完整ｍＲＮＡ进行片段化处理后反转录合成ｃＤＮＡ第一??条链，继而合成第二条链；在双链ＤＮＡ的５’端进行补平并磷酸化，??３’末端加“Ａ”再连接一个“Ｔ”接头后进行ＰＣＲ扩增；最后通过热变??性ＰＣＲ将产物变成单链后再环化即得到了单链环状ＤＮＡ文库。??本研宄文库的构建以及测序由深圳华大基因股份有限公司完成。??Ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ??＾?ｍＲＮＡ?ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ?ｏｒ?ｒＲＮＡ?ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ??ｍＲＮＡ??——??ｆｒａｇｍｅｎｔ?ｉ??＾?Ｒａｎｄｏｍ?Ｎ６?ｐｒｉｍｅｒ??Ｒｅｖｅｒｓｅ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ??Ｉ?１．?Ｓｅｃｏｎｄ?ｓｔｒａｎｄ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ??＾?２．?ＥＲ／Ａ?ｔａｉｆｉｎｇ??ｃＤＮＡ＾??＾??Ｉ?Ｂｕｂｂｌｅ?ａｄａｐｔｅｒ?ｌｉｇａｔｉｏｎ??５＊—Ｊ?Ｔ?＾?３＊??Ｔ?５＊??ｉ?ＰＣＲ??，＾?Ｈｅａｔ?ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ??＼?ｓｓＣｉｒｃ??ＳｆＨｉｎｔ?ｏｌｉｇｏ??ＵＤＸＢ?＾?Ｓｅｑｕｅｎｃｅ??＾?ｍａｋｉｎｇ?＾?ｆｏｒＳＥＳＯ??图２－１．转录组文库构建流程图??２．２．６．２数据过滤??测序所得的原始数据称为ｍｗ?ｒｅａｄｓ；为了保证后续信息分析结果??的可靠性
２．２．７?ｓＲＮＡ高通量测序??２．２．７．１?ｓＲＮＡｃＤＮＡ文库构建及测序??文库构建流程如图２－２所示，首先使用２．２．４步骤提取的Ｔｏｔａｌ??ＲＮＡ，通过ＰＡＧＥ胶分离ＲＮＡ；切取并回收１８？３０?ｎｔ之间的ｓＲＮＡ；??然后在连接５?’和３?’端接头后进行反转录；最后ＰＣＲ扩增进行胶回收，??构建文库；对构建好的文库进行质量和产量的检测。本研究的ｓＲＮＡ??ｃＤＮＡ文库构建及测序由深圳华大基因股份有限公司完成。??Ｓｍａｌｔ?ＲＮＡ?Ｌｅｎｇｔｈ??５＊?ｐ?■?｜?｜?｜?｜?｜?ｒｉ?Ｉ?■?■?■?Ｉ?■?？Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?〇?＾?１８－３０?ｎｔ??３＊?ａｄａｐｔｏｒ?ｌｉｇａｔｉｏｎ??５．?Ｉ?ｎ?ＩＩ?Ｍ?？?Ｔ?Ｉ?１１?Ｉ?ｆ?Ｉ?Ｉ?ＩＩ?ｆ?＾?Ｔａｄａｐｔｅ，ｆ?３６－５０?ｎｔ??５＊．ａｄａｐｔｏｒ?ｌｉｇａｔｉｏｎ?Ｉ?刺?１４獅??ｉ?．Ｔｆｒ．?■．?ＭＴＴ－ｎ?ｉ?ｉｉ?ｎ?ＴＴｙｎ－ｒｒｒｒｆ?＾?６２－７５?ｎｔ??Ｔ＊？ＲＮ?Ａ??ｙ?ａｄａｐｔｏｒ?Ｓ＊?３’??■?■?■１１?＿?■１??？?Ｉ?？、ＴＴ??ＲＴ?ｐｒｓｎｅｒ??Ｉ?Ｒｅｖｅｒｓｅ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ??ｃＤＮＡ?＃??１?ＩＮＩ?Ｔｉｌｌ?１?ＩＩ?Ｉ?ＩＩＩＩ?ｉ?Ｉ?ＩＩＩ?Ｉ?ＩＩ??ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
【参考文献】：
期刊论文
[1]BMP signaling in homeostasis, transformation and inflammatory response of intestinal epithelium[J]. Shan Wang,Ye-Guang Chen. Science China（Life Sciences）. 2018(07)
[2]miRNAs对动物肠道健康的调控作用[J]. 王珂星,邹立军,熊霞,印遇龙. 生命科学研究. 2018(01)
[3]Paneth cells in intestinal physiology and pathophysiology[J]. Nikolaus Gassler. World Journal of Gastrointestinal Pathophysiology. 2017(04)
[4]肠道隐窝-绒毛轴上皮细胞更新及调控机制研究进展[J]. 邹立军,熊霞,王小城,杨焕胜,李建中,黄鹏飞,印遇龙. 中国科学:生命科学. 2017(02)
[5]山羊碱性氨基酸转运载体基因SLC3A1 cDNA序列克隆及表达[J]. 周英昊,高晔,刘林丽,曾洁,杨雨鑫,张恩平,陈玉林. 中国畜牧兽医. 2015(10)
[6]Ghrelin对大鼠小肠转运的作用及对中枢和胃肠道c-Fos表达的影响[J]. 王燕,史海涛,秦斌,姜炅,赵菊辉,赵红莉. 西安交通大学学报(医学版). 2014(05)
[7]Feed- and feed additives-related aspects of gut health and development in weanling pigs[J]. John R Pluske. Journal of Animal Science and Biotechnology. 2013(02)
[8]肠道上皮细胞特异转录因子CDX2研究进展[J]. 冯幼,王修启,江青艳. 中国畜牧兽医. 2009(06)
本文编号：3453657
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：160 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１－１小肠上皮的结构和自我更新［１９］??由ＩＳＣｓ分化形成的Ｐａｎｅｔｈ细胞向下迁移至隐窝底部，而其他三??
??转录组文库构建流程如图２－１所示。首先纯化Ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ：用??Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）磁珠富集含有ｐｏｌｙＡ尾的ｍＲＮＡ；?ＤＮＡ探针杂交ｒＲＮＡ，??随后分别用ＲＮａｓｅＨ和ＤＮａｓｅ?Ｉ消化掉ＤＮＡ／ｒＲＮＡ双链和ＤＮＡ探针。??然后对获得的完整ｍＲＮＡ进行片段化处理后反转录合成ｃＤＮＡ第一??条链，继而合成第二条链；在双链ＤＮＡ的５’端进行补平并磷酸化，??３’末端加“Ａ”再连接一个“Ｔ”接头后进行ＰＣＲ扩增；最后通过热变??性ＰＣＲ将产物变成单链后再环化即得到了单链环状ＤＮＡ文库。??本研宄文库的构建以及测序由深圳华大基因股份有限公司完成。??Ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ??＾?ｍＲＮＡ?ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ?ｏｒ?ｒＲＮＡ?ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ??ｍＲＮＡ??——??ｆｒａｇｍｅｎｔ?ｉ??＾?Ｒａｎｄｏｍ?Ｎ６?ｐｒｉｍｅｒ??Ｒｅｖｅｒｓｅ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ??Ｉ?１．?Ｓｅｃｏｎｄ?ｓｔｒａｎｄ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ??＾?２．?ＥＲ／Ａ?ｔａｉｆｉｎｇ??ｃＤＮＡ＾??＾??Ｉ?Ｂｕｂｂｌｅ?ａｄａｐｔｅｒ?ｌｉｇａｔｉｏｎ??５＊—Ｊ?Ｔ?＾?３＊??Ｔ?５＊??ｉ?ＰＣＲ??，＾?Ｈｅａｔ?ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ??＼?ｓｓＣｉｒｃ??ＳｆＨｉｎｔ?ｏｌｉｇｏ??ＵＤＸＢ?＾?Ｓｅｑｕｅｎｃｅ??＾?ｍａｋｉｎｇ?＾?ｆｏｒＳＥＳＯ??图２－１．转录组文库构建流程图??２．２．６．２数据过滤??测序所得的原始数据称为ｍｗ?ｒｅａｄｓ；为了保证后续信息分析结果??的可靠性
２．２．７?ｓＲＮＡ高通量测序??２．２．７．１?ｓＲＮＡｃＤＮＡ文库构建及测序??文库构建流程如图２－２所示，首先使用２．２．４步骤提取的Ｔｏｔａｌ??ＲＮＡ，通过ＰＡＧＥ胶分离ＲＮＡ；切取并回收１８？３０?ｎｔ之间的ｓＲＮＡ；??然后在连接５?’和３?’端接头后进行反转录；最后ＰＣＲ扩增进行胶回收，??构建文库；对构建好的文库进行质量和产量的检测。本研究的ｓＲＮＡ??ｃＤＮＡ文库构建及测序由深圳华大基因股份有限公司完成。??Ｓｍａｌｔ?ＲＮＡ?Ｌｅｎｇｔｈ??５＊?ｐ?■?｜?｜?｜?｜?｜?ｒｉ?Ｉ?■?■?■?Ｉ?■?？Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?〇?＾?１８－３０?ｎｔ??３＊?ａｄａｐｔｏｒ?ｌｉｇａｔｉｏｎ??５．?Ｉ?ｎ?ＩＩ?Ｍ?？?Ｔ?Ｉ?１１?Ｉ?ｆ?Ｉ?Ｉ?ＩＩ?ｆ?＾?Ｔａｄａｐｔｅ，ｆ?３６－５０?ｎｔ??５＊．ａｄａｐｔｏｒ?ｌｉｇａｔｉｏｎ?Ｉ?刺?１４獅??ｉ?．Ｔｆｒ．?■．?ＭＴＴ－ｎ?ｉ?ｉｉ?ｎ?ＴＴｙｎ－ｒｒｒｒｆ?＾?６２－７５?ｎｔ??Ｔ＊？ＲＮ?Ａ??ｙ?ａｄａｐｔｏｒ?Ｓ＊?３’??■?■?■１１?＿?■１??？?Ｉ?？、ＴＴ??ＲＴ?ｐｒｓｎｅｒ??Ｉ?Ｒｅｖｅｒｓｅ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ??ｃＤＮＡ?＃??１?ＩＮＩ?Ｔｉｌｌ?１?ＩＩ?Ｉ?ＩＩＩＩ?ｉ?Ｉ?ＩＩＩ?Ｉ?ＩＩ??ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
【参考文献】：
期刊论文
[1]BMP signaling in homeostasis, transformation and inflammatory response of intestinal epithelium[J]. Shan Wang,Ye-Guang Chen. Science China（Life Sciences）. 2018(07)
[2]miRNAs对动物肠道健康的调控作用[J]. 王珂星,邹立军,熊霞,印遇龙. 生命科学研究. 2018(01)
[3]Paneth cells in intestinal physiology and pathophysiology[J]. Nikolaus Gassler. World Journal of Gastrointestinal Pathophysiology. 2017(04)
[4]肠道隐窝-绒毛轴上皮细胞更新及调控机制研究进展[J]. 邹立军,熊霞,王小城,杨焕胜,李建中,黄鹏飞,印遇龙. 中国科学:生命科学. 2017(02)
[5]山羊碱性氨基酸转运载体基因SLC3A1 cDNA序列克隆及表达[J]. 周英昊,高晔,刘林丽,曾洁,杨雨鑫,张恩平,陈玉林. 中国畜牧兽医. 2015(10)
[6]Ghrelin对大鼠小肠转运的作用及对中枢和胃肠道c-Fos表达的影响[J]. 王燕,史海涛,秦斌,姜炅,赵菊辉,赵红莉. 西安交通大学学报(医学版). 2014(05)
[7]Feed- and feed additives-related aspects of gut health and development in weanling pigs[J]. John R Pluske. Journal of Animal Science and Biotechnology. 2013(02)
[8]肠道上皮细胞特异转录因子CDX2研究进展[J]. 冯幼,王修启,江青艳. 中国畜牧兽医. 2009(06)
本文编号：3453657
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