检测牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接ELISA的建立与应用
发布时间：2021-10-27 09:11
牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV）是一种小的单股正链RNA病毒,属于黄病毒科瘟病毒属的成员。该病毒对牛的生产性能影响极大,可以引起流产、产出畸形胎儿或者持续性感染小牛,这对养牛业造成了极大的经济损失。持续感染的动物通常比短暂或急性感染的动物更有效地传播BVDV,因为它们能够终生排毒,并且被认为是BVDV的主要宿主。近年来国内BVDV感染率较高且逐渐上升。此外,我国进口的牛数量逐渐增加,因此必须加强对BVDV的检疫和防控。国内目前在检测BVDV血清抗体时主要是病毒中和试验和商品化试剂盒,但病毒中和试验不适合血清的大规模检测,而商品化试剂盒价格昂贵。为此,本研究开展了建立检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法的研究,为国内BVDV的防控提供技术支持。BVDV最具免疫原性的蛋白包括结构蛋白Erns（E0）和E2及非结构蛋白P80,三者均可应用于检测牛血清中针对BVDV的抗体。其中E0和E2蛋白是BVDV结构蛋白,是其主要的免疫原,可诱导中和抗体,是抗体检测的主要靶标。P80蛋白是病毒的非结构蛋白,具有较强的免疫原性,病...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 牛病毒性腹泻病毒的概况
1.1.1 基因分类及遗传多样性
1.1.2 病毒的基因组及编码的蛋白
1.2 BVDV的传染源、传播途径及宿主
1.3 国内外流行情况
1.4 检测
1.4.1 BVDV特异性抗体检测
1.4.2 抗原/病毒检测
1.5 BVDV感染的防控
1.6 研究目的及意义
第二章 以BVDV的重组P80 蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法的建立及应用
2.1 材料与方法
2.1.1 病毒、质粒和菌种
2.1.2 主要试剂
2.1.3 血清样品
2.1.4 纯化蛋白有关溶液
2.1.5 重组蛋白P80的原核表达和鉴定
2.1.6 P80重组蛋白的纯化
2.1.7 P80重组蛋白的复性
2.1.8 以P80 蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法建立
2.1.9 包被条件的确定
2.1.10 最佳封闭液和封闭时间的确定
2.1.11 血清最佳孵育时间的确定
2.1.12 二抗最佳稀释比例的确定
2.1.13 二抗最佳孵育时间的确定
2.1.14 显色液的最佳显色时间的确定
2.1.15 临界值的确定
2.1.16 特异性试验
2.1.17 敏感性试验
2.1.18 重复性试验
2.1.19 与病毒中和试验的符合率试验
2.1.20 牛血清样品的检测
2.2 结果
2.2.1 重组P80蛋白的原核表达鉴定及纯化
2.2.2 方阵滴定
2.2.3 包被条件的优化
2.2.4 封闭条件的优化
2.2.5 血清的最佳作用时间
2.2.6 二抗最佳稀释比例的确定
2.2.7 二抗最佳孵育时间的确定
2.2.8 显色液的最佳显色时间的确定
2.2.9 临界值的确定
2.2.10 特异性试验结果
2.2.11 敏感性试验
2.2.12 重复性试验结果
2.2.13 与病毒中和试验的符合率
2.2.14 建立的间接ELISA方法的初步应用
2.3 讨论
第三章 以BVDV的重组E2 蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法的建立及应用
3.1 材料与方法
3.1.1 病毒、质粒和菌种
3.1.2 主要试剂
3.1.3 血清样品
3.1.4 纯化蛋白有关溶液
3.1.5 原核表达和鉴定重组蛋白E2
3.1.6 E2重组蛋白的纯化
3.1.7 E2重组蛋白的复性
3.1.8 以E2 蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法建立
3.1.9 包被条件的确定
3.1.10 封闭液和封闭时间的确定
3.1.11 血清最佳孵育时间的确定
3.1.12 二抗最佳稀释比例的确定
3.1.13 确定二抗最佳孵育时间
3.1.14 最佳显色时间的确定
3.1.15 临界值的确定
3.1.16 特异性试验
3.1.17 敏感性试验
3.1.18 重复性试验
3.1.19 与病毒中和试验的符合率试验
3.1.20 牛血清样品的检测
3.2 结果
3.2.1 重组E2蛋白的原核表达鉴定及纯化
3.2.2 方阵滴定
3.2.3 优化包被条件
3.2.4 封闭条件的优化
3.2.5 血清的最佳作用时间
3.2.6 二抗最佳稀释比例的确定
3.2.7 二抗最佳孵育时间的确定
3.2.8 显色液的最佳显色时间的确定
3.2.9 临界值的确定
3.2.10 特异性试验结果
3.2.11 敏感性试验结果
3.2.12 重复性试验结果
3.2.13 与病毒中和试验的符合率
3.2.14 牛血清现地样品的检测结果
3.3 讨论
第四章 以BVDV的重组E0 蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法的建立及应用
4.1 材料与方法
4.1.1 病毒、质粒和菌种
4.1.2 主要试剂
4.1.3 血清样品
4.1.4 纯化蛋白有关溶液
4.1.5 重组蛋白E0的原核表达和鉴定
4.1.6 E0重组蛋白的纯化
4.1.7 E0重组蛋白的复性
4.1.8 以E0 蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法建立
4.1.9 包被条件的确定
4.1.10 最佳封闭液和封闭时间的确定
4.1.11 血清最佳孵育时间的确定
4.1.12 二抗最佳稀释比例的确定
4.1.13 确定二抗最佳孵育时间
4.1.14 显色液的最佳显色时间的确定
4.1.15 临界值的确定
4.1.16 特异性试验
4.1.17 敏感性试验
4.1.18 重复性试验
4.1.19 与病毒中和试验的符合率试验
4.1.20 牛血清样品的检测
4.2 结果
4.2.1 重组E0蛋白的原核表达鉴定及纯化
4.2.2 方阵滴定
4.2.3 优化包被条件
4.2.4 封闭条件的优化
4.2.5 血清的最佳作用时间
4.2.6 二抗最佳稀释比例的确定
4.2.7 确定二抗的最佳孵育时间
4.2.8 显色液的最佳显色时间的确定
4.2.9 临界值的确定
4.2.10 特异性试验结果
4.2.11 敏感性试验结果
4.2.12 重复性试验结果
4.2.13 与病毒中和试验的符合率
4.2.14 牛血清现地样品的检测结果
4.3 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3461299
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 牛病毒性腹泻病毒的概况
1.1.1 基因分类及遗传多样性
1.1.2 病毒的基因组及编码的蛋白
1.2 BVDV的传染源、传播途径及宿主
1.3 国内外流行情况
1.4 检测
1.4.1 BVDV特异性抗体检测
1.4.2 抗原/病毒检测
1.5 BVDV感染的防控
1.6 研究目的及意义
第二章 以BVDV的重组P80 蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法的建立及应用
2.1 材料与方法
2.1.1 病毒、质粒和菌种
2.1.2 主要试剂
2.1.3 血清样品
2.1.4 纯化蛋白有关溶液
2.1.5 重组蛋白P80的原核表达和鉴定
2.1.6 P80重组蛋白的纯化
2.1.7 P80重组蛋白的复性
2.1.8 以P80 蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法建立
2.1.9 包被条件的确定
2.1.10 最佳封闭液和封闭时间的确定
2.1.11 血清最佳孵育时间的确定
2.1.12 二抗最佳稀释比例的确定
2.1.13 二抗最佳孵育时间的确定
2.1.14 显色液的最佳显色时间的确定
2.1.15 临界值的确定
2.1.16 特异性试验
2.1.17 敏感性试验
2.1.18 重复性试验
2.1.19 与病毒中和试验的符合率试验
2.1.20 牛血清样品的检测
2.2 结果
2.2.1 重组P80蛋白的原核表达鉴定及纯化
2.2.2 方阵滴定
2.2.3 包被条件的优化
2.2.4 封闭条件的优化
2.2.5 血清的最佳作用时间
2.2.6 二抗最佳稀释比例的确定
2.2.7 二抗最佳孵育时间的确定
2.2.8 显色液的最佳显色时间的确定
2.2.9 临界值的确定
2.2.10 特异性试验结果
2.2.11 敏感性试验
2.2.12 重复性试验结果
2.2.13 与病毒中和试验的符合率
2.2.14 建立的间接ELISA方法的初步应用
2.3 讨论
第三章 以BVDV的重组E2 蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法的建立及应用
3.1 材料与方法
3.1.1 病毒、质粒和菌种
3.1.2 主要试剂
3.1.3 血清样品
3.1.4 纯化蛋白有关溶液
3.1.5 原核表达和鉴定重组蛋白E2
3.1.6 E2重组蛋白的纯化
3.1.7 E2重组蛋白的复性
3.1.8 以E2 蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法建立
3.1.9 包被条件的确定
3.1.10 封闭液和封闭时间的确定
3.1.11 血清最佳孵育时间的确定
3.1.12 二抗最佳稀释比例的确定
3.1.13 确定二抗最佳孵育时间
3.1.14 最佳显色时间的确定
3.1.15 临界值的确定
3.1.16 特异性试验
3.1.17 敏感性试验
3.1.18 重复性试验
3.1.19 与病毒中和试验的符合率试验
3.1.20 牛血清样品的检测
3.2 结果
3.2.1 重组E2蛋白的原核表达鉴定及纯化
3.2.2 方阵滴定
3.2.3 优化包被条件
3.2.4 封闭条件的优化
3.2.5 血清的最佳作用时间
3.2.6 二抗最佳稀释比例的确定
3.2.7 二抗最佳孵育时间的确定
3.2.8 显色液的最佳显色时间的确定
3.2.9 临界值的确定
3.2.10 特异性试验结果
3.2.11 敏感性试验结果
3.2.12 重复性试验结果
3.2.13 与病毒中和试验的符合率
3.2.14 牛血清现地样品的检测结果
3.3 讨论
第四章 以BVDV的重组E0 蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法的建立及应用
4.1 材料与方法
4.1.1 病毒、质粒和菌种
4.1.2 主要试剂
4.1.3 血清样品
4.1.4 纯化蛋白有关溶液
4.1.5 重组蛋白E0的原核表达和鉴定
4.1.6 E0重组蛋白的纯化
4.1.7 E0重组蛋白的复性
4.1.8 以E0 蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法建立
4.1.9 包被条件的确定
4.1.10 最佳封闭液和封闭时间的确定
4.1.11 血清最佳孵育时间的确定
4.1.12 二抗最佳稀释比例的确定
4.1.13 确定二抗最佳孵育时间
4.1.14 显色液的最佳显色时间的确定
4.1.15 临界值的确定
4.1.16 特异性试验
4.1.17 敏感性试验
4.1.18 重复性试验
4.1.19 与病毒中和试验的符合率试验
4.1.20 牛血清样品的检测
4.2 结果
4.2.1 重组E0蛋白的原核表达鉴定及纯化
4.2.2 方阵滴定
4.2.3 优化包被条件
4.2.4 封闭条件的优化
4.2.5 血清的最佳作用时间
4.2.6 二抗最佳稀释比例的确定
4.2.7 确定二抗的最佳孵育时间
4.2.8 显色液的最佳显色时间的确定
4.2.9 临界值的确定
4.2.10 特异性试验结果
4.2.11 敏感性试验结果
4.2.12 重复性试验结果
4.2.13 与病毒中和试验的符合率
4.2.14 牛血清现地样品的检测结果
4.3 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3461299
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