梅花鹿生茸区骨膜干细胞Galectin-1基因RNAi重组慢病毒载体的构建
发布时间：2021-10-27 09:31
当代，随着养鹿产业的快速发展，鹿肉在欧洲很多国家已成为一种餐桌食品，但在一些东南亚国家例如中国、日本等，人们更注重的是鹿茸的价值。鹿茸在中医药学中具有提高机体免疫力、抗衰老、促进创伤愈合和骨质修复等作用，被广泛的用于治疗或滋补。鹿茸是哺乳动物中唯一能周期性完全再生的附属器官，是研究哺乳动物器官修复及再生的绝佳生物模型。鹿茸的再生源于生茸干细胞，最快生长速度可以达到1～2cm/d，媲美癌细胞，但高速的生长并未使鹿茸发生癌变，这为癌症的研究提供了新的医学模型。Galectin-1（半乳糖凝集素1）分子量约为14kDa，是一种糖结合蛋白，动物凝集素家族的成员之一。Galectin-1（Gal-1）与神经修复、血管再生、软骨形成等多个生物过程相关，现阶段对它的研究主要集中在癌变过程中，也有其在胚胎发育过程中的研究报道。鹿茸的再生过程涉及了神经、血管、软骨、皮肤等的生长，研究表明，Gal-1在生茸干细胞中的表达量与普通细胞中的不同，在两种生茸干细胞之中的表达量也不相同。令人感兴趣的是，Gal-1在生茸干细胞中的大量表达并未引起鹿茸的癌变，也就是说，研究Gal-1在鹿茸再生机制中的作用十分重要的。...
【文章来源】：江苏科技大学江苏省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
英文缩略表
第1章 绪论
1.1 引言
1.2 研究背景
1.2.1 鹿茸的发生
1.2.2 鹿茸的再生
1.2.3 Galectin-1 的生物学特性与功能
1.2.4 鹿茸干细胞中的 Galectin-1
1.3 研究的目的及意义
1.4 研究内容
第2章 GAL-1 基因重组慢病毒载体的构建及鉴定
2.1 实验材料
2.1.1 实验试剂
2.1.2 主要试剂配制
2.1.3 实验主要仪器
2.1.4 慢病毒系统
2.2 实验方法
2.2.1 东北梅花鹿 Gal-1 基因 RNAi 靶位点的筛选
2.2.2 shRNA 寡核苷酸链
2.2.3 shRNA 退火
2.2.4 感受态细胞的制备
2.2.5 载体质粒的转化、小摇
2.2.6 载体质粒 DNA 的小量提取
2.2.7 载体质粒的酶切
2.2.8 载体质粒 DNA 片段的胶回收
2.2.9 重组片段的连接、转化及小量提取
2.2.10 重组载体质粒的鉴定
2.3 实验结果
2.3.1 shRNA 寡核苷酸链退火结果
2.3.2 载体质粒的酶切结果
2.3.3 重组 pLVTHM 的 PCR 鉴定结果
2.3.4 重组质粒测序结果
2.4 讨论
2.5 本章小结
第3章 重组慢病毒的获得
3.1 实验材料
3.3.1 实验试剂
3.3.2 主要试剂配制
3.2 实验仪器
3.3 实验方法
3.3.1 psPAX2 的酶切鉴定
3.3.2 慢病毒三质粒的无内毒素大量提取
3.3.3 复苏 293t 细胞
3.3.4 293t 细胞的传代培养
3.3.5 重组慢病毒的包装
3.3.6 病毒的收集、浓缩
3.4 实验结果
3.4.1 psPAX2 酶切鉴定结果
3.4.2 病毒包装结果
3.5 讨论
3.6 本章小结
第4章 生茸区骨膜干细胞原代培养及重组慢病毒的感染
4.1 实验耗材
4.2 实验仪器
4.3 实验步骤
4.3.1 生茸区骨膜干细胞原代培养
4.3.2 生茸区骨膜干细胞的传代及冻存
4.3.3 病毒感染生茸区骨膜干细胞
4.3.4 提取细胞总 RNA
4.3.5 RT-PCR 反应
4.4 实验结果
4.4.1 原代培养结果
4.4.2 感染结果
4.4.3 RT-PCR 检测结果
4.5 讨论
4.6 本章小结
第5章 结论
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]半乳糖凝集素1蛋白及其生物学功能[J]. 秦欣欣,孙红梅,赵海平,褚文辉,王大涛,李春义. 中国畜牧兽医. 2012(06)
[2]Galectin-1在鼻咽癌中的表达与意义[J]. 汤参娥,谭潭,苏涛,李萃,肖志强. 中国现代医学杂志. 2010(12)
[3]Galectin-1在胃癌组织中的表达及在胃癌血管生成中的作用[J]. 李富新,何小玲,付强,王鹏志. 山东医药. 2010(24)
[4]蛋白质组学技术分析5-aza-2dC处理白血病细胞HL-60前后的差异表达蛋白质[J]. 谭潭,梁婷,汤参娥,肖艳华,易红,张鹏飞,彭芳,陈主初,肖志强. 国际病理科学与临床杂志. 2009(02)
[5]半乳凝素1诱导脑损伤大鼠内源性神经干细胞原位增殖及定向分化[J]. 盛宝英,陈雪寒,黄作义,魏春杰,邹春颖. 中国组织工程研究与临床康复. 2008(47)
[6]RNAi技术在植物功能基因组学中的研究进展[J]. 李丽文,朱延明,李杰,柏锡,才华. 东北农业大学学报. 2007(01)
[7]RNAi技术的研究进展和发展前景[J]. 李成,张滨丽,李杰. 东北农业大学学报. 2005(03)
[8]激活人胶质瘤细胞CXCR4受体对血管内皮生长因子表达的影响[J]. 杨世昕,卞修武,蒋雪峰,陈剑鸿,王清良,王吉民. 中华医学杂志. 2005(12)
[9]用于基因治疗的慢病毒载体[J]. 伍志坚,黄海金,梁国栋. 中华实验和临床病毒学杂志. 1998(02)
[10]人骨膜成骨细胞培养及初步观察[J]. 欧阳钧,王前,王国英,钟世镇. 中华骨科杂志. 1995(11)
博士论文
[1]RNA干扰沉默cbfa1基因对鹿茸干细胞成骨抑制作用的研究[D]. 孙红梅.中国农业科学院 2010
本文编号：3461330
【文章来源】：江苏科技大学江苏省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
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摘要
Abstract
目录
英文缩略表
第1章 绪论
1.1 引言
1.2 研究背景
1.2.1 鹿茸的发生
1.2.2 鹿茸的再生
1.2.3 Galectin-1 的生物学特性与功能
1.2.4 鹿茸干细胞中的 Galectin-1
1.3 研究的目的及意义
1.4 研究内容
第2章 GAL-1 基因重组慢病毒载体的构建及鉴定
2.1 实验材料
2.1.1 实验试剂
2.1.2 主要试剂配制
2.1.3 实验主要仪器
2.1.4 慢病毒系统
2.2 实验方法
2.2.1 东北梅花鹿 Gal-1 基因 RNAi 靶位点的筛选
2.2.2 shRNA 寡核苷酸链
2.2.3 shRNA 退火
2.2.4 感受态细胞的制备
2.2.5 载体质粒的转化、小摇
2.2.6 载体质粒 DNA 的小量提取
2.2.7 载体质粒的酶切
2.2.8 载体质粒 DNA 片段的胶回收
2.2.9 重组片段的连接、转化及小量提取
2.2.10 重组载体质粒的鉴定
2.3 实验结果
2.3.1 shRNA 寡核苷酸链退火结果
2.3.2 载体质粒的酶切结果
2.3.3 重组 pLVTHM 的 PCR 鉴定结果
2.3.4 重组质粒测序结果
2.4 讨论
2.5 本章小结
第3章 重组慢病毒的获得
3.1 实验材料
3.3.1 实验试剂
3.3.2 主要试剂配制
3.2 实验仪器
3.3 实验方法
3.3.1 psPAX2 的酶切鉴定
3.3.2 慢病毒三质粒的无内毒素大量提取
3.3.3 复苏 293t 细胞
3.3.4 293t 细胞的传代培养
3.3.5 重组慢病毒的包装
3.3.6 病毒的收集、浓缩
3.4 实验结果
3.4.1 psPAX2 酶切鉴定结果
3.4.2 病毒包装结果
3.5 讨论
3.6 本章小结
第4章 生茸区骨膜干细胞原代培养及重组慢病毒的感染
4.1 实验耗材
4.2 实验仪器
4.3 实验步骤
4.3.1 生茸区骨膜干细胞原代培养
4.3.2 生茸区骨膜干细胞的传代及冻存
4.3.3 病毒感染生茸区骨膜干细胞
4.3.4 提取细胞总 RNA
4.3.5 RT-PCR 反应
4.4 实验结果
4.4.1 原代培养结果
4.4.2 感染结果
4.4.3 RT-PCR 检测结果
4.5 讨论
4.6 本章小结
第5章 结论
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]半乳糖凝集素1蛋白及其生物学功能[J]. 秦欣欣,孙红梅,赵海平,褚文辉,王大涛,李春义. 中国畜牧兽医. 2012(06)
[2]Galectin-1在鼻咽癌中的表达与意义[J]. 汤参娥,谭潭,苏涛,李萃,肖志强. 中国现代医学杂志. 2010(12)
[3]Galectin-1在胃癌组织中的表达及在胃癌血管生成中的作用[J]. 李富新,何小玲,付强,王鹏志. 山东医药. 2010(24)
[4]蛋白质组学技术分析5-aza-2dC处理白血病细胞HL-60前后的差异表达蛋白质[J]. 谭潭,梁婷,汤参娥,肖艳华,易红,张鹏飞,彭芳,陈主初,肖志强. 国际病理科学与临床杂志. 2009(02)
[5]半乳凝素1诱导脑损伤大鼠内源性神经干细胞原位增殖及定向分化[J]. 盛宝英,陈雪寒,黄作义,魏春杰,邹春颖. 中国组织工程研究与临床康复. 2008(47)
[6]RNAi技术在植物功能基因组学中的研究进展[J]. 李丽文,朱延明,李杰,柏锡,才华. 东北农业大学学报. 2007(01)
[7]RNAi技术的研究进展和发展前景[J]. 李成,张滨丽,李杰. 东北农业大学学报. 2005(03)
[8]激活人胶质瘤细胞CXCR4受体对血管内皮生长因子表达的影响[J]. 杨世昕,卞修武,蒋雪峰,陈剑鸿,王清良,王吉民. 中华医学杂志. 2005(12)
[9]用于基因治疗的慢病毒载体[J]. 伍志坚,黄海金,梁国栋. 中华实验和临床病毒学杂志. 1998(02)
[10]人骨膜成骨细胞培养及初步观察[J]. 欧阳钧,王前,王国英,钟世镇. 中华骨科杂志. 1995(11)
博士论文
[1]RNA干扰沉默cbfa1基因对鹿茸干细胞成骨抑制作用的研究[D]. 孙红梅.中国农业科学院 2010
本文编号：3461330
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