产气荚膜梭菌ε毒素Domain Ⅲ功能性氨基酸的鉴定及减毒突变体免疫保护性研究

发布时间：2021-10-27 20:25

　　ε毒素（Etx）是由B型和D型产气荚膜梭菌产生的一种具有超强毒力的外毒素,属于β穿孔素家族的成员。Etx是引起家畜发生梭菌性肠毒血症的主要致病因子,动物一旦发病,死亡率几乎为100%。通过免疫接种产生针对Etx的保护性抗体是防控疾病的有效途径。本研究在分析Etx三维结构的基础上,通过对其Domain Ⅲ的芳香族氨基酸簇进行定点突变构建了一系列Etx突变体,并采用MDCK细胞毒性试验、钙离子内流试验、检测毒素在细胞膜上的结合与聚合、小鼠致死性试验等手段对Etx突变体的功能进行鉴定。结果表明,位于Domain Ⅲ的第71位酪氨酸（Y71）是影响Etx毒力的关键氨基酸,而且第71位氨基酸残基的侧链芳香环基团是毒素体外杀细胞活性和体内致死性的决定因素。为了进一步确定构建的减毒突变体作为亚单位疫苗抗原的潜力,我们选择Etx-Y71 A作为代表性突变体进行动物体内安全性和免疫原性研究。Etx-Y71A接种小鼠后的病理学观察显示,小鼠没有出现任何病理损伤;GFP荧光示踪试验也显示Etx-Y71A丧失了穿越小鼠血脑屏障的能力,表明Etx-Y71A在动物体内具有良好的安全性。同源建模和圆二色谱分析均显示... 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：58 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图１．１ｓ前毒素单体结构示意图??

?中国农业科学院博士后研究报告???１２〇ｈ??Ｅｔｘ－Ｙ７１Ｅ??１００－?，??＋?Ｅｔｘ－Ｙ７１Ｗ??＝５?８０－?＼?＇?Ｅｔｘ－Ｙ７１Ｓ??荃?｜?＼?＼?＋?Ｅｔｘ－Ｙ７１Ｆ??｜?Ｓ?６０－?＼?＼?＋?Ｅｔｘ－Ｙ７１Ｇ??５?＾?４０－?＼?＼?Ｅｔｘ－Ｙ７１Ａ??、Ｗ?，，，Ｅｔｘ??〇Ｊ＿，?，?ｒ?．?ｆ—??图２．４?Ｅｔｘ－Ｙ７１突变体对ＭＤＣＫ细胞的毒性??Ｆｉｇ．?２．４?Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ?ｏｆ?ｔｈｅ?Ｙ７１?ｍｕｔａｎｔｓ?ｏｆ?ｓ?ｔｏｘｉｎ?ｔｏｗａｒｄｓ?ｔｏ?ＭＤＣＫ?ｃｅｌｌｓ??２．２．５?Ｅｔｘ突变体对ＭＤＣＫ细胞的穿孔效应??采用细胞钙离子内流试验检测毒素作用细胞后钙离子浓度的变化，??以确定Ｅｔｘ及其突变体对细胞的穿孔效应。将Ｄｏｍａｉｎ?ＩＩＩ芳香族氨基酸突??变体（Ｅｔｘ－Ｙ７１Ａ、Ｅｔｘ－Ｆ９２Ａ、Ｅｔｘ－Ｙ１６９Ａ?与?Ｅｔｘ－Ｙ２５４Ａ）与?ＭＤＣＫ?细??胞作用，通过荧光信号强度来检测细胞内钙离子的浓度的变化，结果如??图２．５Ａ所示。Ｅｔｘ－Ｆ９２Ａ，Ｅｔｘ－Ｙ１６９Ａ与Ｅｔｘ－Ｙ２５４Ａ作用细胞后，细胞内??的钙离子浓度明显增加，其中Ｅｔｘ－Ｙ１６９Ａ与Ｅｔｘ－Ｙ２５４Ａ导致钙离子升高??的程度与速度与Ｅｔｘ相似，高于Ｅｔｘ－Ｆ９２Ａ，表明这３个突变体均能够导??致ＭＤＣＫ细胞的穿孔效应，其中Ｙ１６９与Ｙ２５４两个位点的突变对Ｅｔｘ??的穿孔效应没有影响；Ｆ９２的突变则使毒素的穿孔效应有所降低；而??Ｅｔｘ－Ｙ７１Ａ作用细胞后，细胞内钙离子浓度并没有出现明显的改变，表明??该位点的突变导致毒素丧失对细胞的穿孔

０－?—?１ｍｇＥｔｘ－Ｈ１０６Ｐ?Ｅ?６０－?＾?１?ｍｇ?Ｅｔｘ－Ｈ１Ｇ６Ｐ??１?＋?删?Ｐ破消?２??Ｓ?４０－?－?－?ＰＢＳ?ｓ?４０－?－?－?ＰＢＳ??Ｏ?ｕ??Ｏ?４）??２０－?ａ?２０－??〇?Ｉ１?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?〇?．?ｒ?ｉ?°?ｉ?＂ｉ??０?８?１６?２４?３２?４０?４８?０?８?１６?２４?３２?４０?４８??Ｈｏｕｒｓ?ｐｏｓｔ?ｃｈａｌｌｅｎｇｅ?Ｈｏｕｒｓ?ｐｏｓｔ?ｃｈａｌｌｅｎｇｅ??图２．丨ｌ?Ｅｔｘ－Ｙ７ｌ?Ａ接种羊血清中Ｅｔｘ特异性抗体及其中和活性??Ｆｉｇ?２．１１?Ｅｔｘ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ａｎｔｉｂｏｄｙ?ａｎｄ?ｉｔｓ?ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｉｎ?ｓｅｒａ?ｆｒｏｍ?Ｅｔｘ－Ｙ７１?Ａ?ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ?ｓｈｅｅｐ??２．２．１４减毒突变体Ｅｔｘ－Ｙ７１Ａ对羔羊的被动免疫??为了评价Ｅｔｘ－Ｙ７１Ａ对新生羔羊的被动免疫效果，本研宄将该突变体??接种３头怀孕母羊（＃３４、＃３７、＃３８），于分挽前６？７周进行接种，并在??首免４周后进行加强免疫，同时将ＰＢＳ接种两头相同规格的怀孕母羊作??为对照（＃３５、＃３６），采用体外中和试验对免疫羊血清进行毒素中和抗??体的检测。结果如图２．１２所示，经两次Ｅｔｘ－Ｙ７１Ａ免疫后，３只母羊血清??３５??


本文编号：3462267