鸡bmp4过表达和敲除载体构建及活性验证

发布时间：2021-10-29 07:15

　　在哺乳动物中,bmp4可以通过BMP信号通路调节原始生殖细胞（Primordial germ cells, PGCs）的形成,但其在鸡PGCs形成过程中的功能和机制仍不清晰。构建鸡bmp4的过表达及敲除载体,并转染DF-1细胞检测活性。通过同源重组技术构建pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP重组载体,转染DF-1细胞,RT-qPCR检测bmp4的表达;根据bmp4 CDS序列设计3个敲除靶位点（gRNA）,插入PGMLV-GM1构建gRNA序列的重组载体bmp4-sgRNA1、bmp4-sgRNA2和bmp4-sgRNA3。Cas9载体与bmp4-sgRNA载体共转染DF-1细胞,T7E1酶切和TA克隆试验检测敲除载体活性及敲除效率。扩增获得bmp4 CDS全长1546 bp,并成功构建pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP载体,将其转染DF-1细胞后有绿色荧光表达（25.17%±0.007）,RT-qPCR检测结果表明,与对照组相比转染pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP的细胞中bmp4显著上调（P<0.01）。3个gRNA重组载体构建成功,转... 

【文章来源】：生物学杂志. 2020,37(03)北大核心CSCD

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【部分图文】：

bmp4 过表达载体构建

为了验证所构建的pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP过表达载体是否能表达GFP蛋白,用测序正确的菌株提取质粒转染DF-1细胞,48 h时观察到绿色荧光(图2-A),说明转染成功。收集细胞提RNA,RT-qPCR检测结果显示,转染过表达载体后,bmp4表达量显著高于转染过表达空载体及空白对照组(P<0.01),且空载与空白对照无显著差异(图2-B)。以上结果均说明构建的bmp4过表达载体有活性,可启动bmp4的表达。2.3 靶向bmp4的sgRNA载体构建

bmp4敲除载体体外活性验证

【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
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本文编号：3464213