弓形虫C-18、MIC11、PI等体内外差异表达基因对NF-κB信号通路的影响

发布时间：2021-10-29 17:45

　　刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种世界范围广泛寄生于人和多种脊椎动物有核细胞中的机会性致病原虫。弓形虫能够感染人、猪、牛、马、羊和鹿等动物,导致孕妇或母畜流产、死胎、畸胎和弱智儿,对人类的生命健康和畜牧业的发展造成严重的威胁。鉴于弓形虫的高度感染率及其在人体医学和畜牧医学中的重要性,探究弓形虫的致病机理和研制安全有效的疫苗显得极其重要,这也是预防和控制人类和动物弓形虫病的重要措施。为此,本研究用RH株弓形虫速殖子感染293T细胞,验证RH株弓形虫速殖子对293T细胞NF-kB信号通路的激活与抑制；通过实时荧光定量PCR（real-time PCR）验证4个体内诱导抗原假定蛋白基因体内外表达的差异；并将其与已经验证过的3个体内外诱导抗原功能基因构建真核表达质粒,探索这些重组质粒对293T细胞中NF-kB信号通路的激活与抑制；以弓形虫体内诱导抗原基因JK483877、 JK483898构建DNA疫苗,并在BALB/c小鼠中检测该疫苗的免疫保护性。（1）弓形虫速殖子全虫对293T细胞的NF-kB信号通路影响收集纯化过的RH株弓形虫速殖子并接种293T细胞,根据双荧光数值分... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 文献综述
    1.1 弓形虫简介
        1.1.1 弓形虫与弓形虫病的发现
        1.1.2 弓形虫的生活史
        1.1.3 与形虫病的流行及危害
    1.2 双荧光素酶报告系统
        1.2.1 荧光素酶报告系统实验原理
        1.2.2 双荧光素酶报告系统的应用
    1.3 NF-κB信号通路研究进展
        1.3.1 NF-κB信号通路概述
        1.3.2 NF-κB信号通路的组成
        1.3.3 病原对NF-κB信号通路的影响
        1.3.4 弓形虫在宿主NF-κB信号通路中的作用
    1.4 弓形虫疫苗研究进展
        1.4.1 弓形虫疫苗现状
        1.4.2 弓形虫疫苗展望
2 研究目的与意义
3 材料与方法
    3.1 实验材料
    3.2 主要仪器与试剂
        3.2.1 主要仪器
        3.2.2 主要试剂
        3.2.3 主要溶液的配置
    3.3 试验方法
        3.3.1 弓形虫的收集与纯化
        3.3.2 速殖子总RNA的提取
        3.3.3 双链cDNA的合成
        3.3.4 体内诱导抗原基因表达差异的验证
        3.3.5 体内诱导抗原真核质粒构建
        3.3.6 速殖子对NF-κB激活作用及对TNF-α诱导NF-κB活化的抑制作用
        3.3.7 体内诱导抗原重组质粒对NF-κB信号通路的激活与抑制
        3.3.8 体内诱导抗原免疫原性的研究
4 结果与分析
    4.1 收集和纯化速殖子
    4.2 速殖子对NF-κB激活作用及对TNF-α诱导的NF-κB活化的抑制作用
        4.2.1 TNF-α对293T细胞NF-κB信号通路激活作用最佳时间的确定
        4.2.2 RH株弓形虫速殖子对293T细胞NF-κB信号通路的激活作用
        4.2.3 RH株弓形虫速殖子对TNF-α诱导的NF-κB活化的抑制作用
    4.3 体内诱导抗原表达差异的验证
    4.4 体内诱导抗原基因真核质粒构建
        4.4.1 体内诱导抗原基因ORF的获得
        4.4.2 目的片段与pMD-19-T载体的连接
        4.4.3 重组真核表达质粒的构建
    4.5 体内诱导抗原基因对293T细胞NF-κB信号通路激活与抑制
        4.5.1 体内诱导抗原基因对293T细胞NF-κB信号通路的激活实验
        4.5.2 体内诱导抗原基因对293T细胞NF-κB信号通路的抑制实验
    4.6 弓形虫体内诱导抗原JK483877、JK483898免疫特性的研究
        4.6.1 重组质粒的抗原性实验
        4.6.2 实验动物血清抗体的检测
        4.6.3 淋巴细胞增殖实验
        4.6.4 细胞因子的检测
        4.6.5 重组质粒对BLAB/c小鼠的保护力实验
5 讨论
    5.1 体内诱导抗原基因表达差异的验证
    5.2 体内诱导抗原基因真核表达质粒的构建
        5.2.1 真核表达载体的选择
        5.2.2 转染方法的选择以及转染效率的提高
    5.3 体内诱导抗原基因对NF-κB信号通路的激活与抑制
    5.4 DNA疫苗
6 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]双荧光素酶报告基因系统的应用研究进展[J]. 耿德玉,原媛,郭华荣.  科技资讯. 2012(21)
[2]弓形虫病研究概况[J]. 王跃兵,杨向东,杨国荣,于彬彬,黄文丽,马永康.  中国热带医学. 2012(04)
[3]弓形虫疫苗的研究概况及前景[J]. 任科研,苑淑贤,李琳,毛文智,苑冬梅,姚新华.  国外畜牧学(猪与禽). 2011(02)
[4]弓形虫疫苗研究的现状与展望[J]. 杨翠萍,万红娇,蔡长春.  中国病原生物学杂志. 2006(03)
[5]弓形虫病研究九十年[J]. 崔君兆.  实用寄生虫病杂志. 2000(02)
[6]弓形虫病100例分析[J]. 甘绍伯,李爽.  中国人兽共患病杂志. 1991(05)
[7]弓形体抗原的免疫化学研究[J]. 沈继龙,徐秉锟.  中国人兽共患病杂志. 1990(04)

博士论文
[1]microRNA-125b的功能研究[D]. 赵爱华.中国人民解放军军医进修学院 2012
[2]ARF对Miz-1抑制p53转录活性的阻抑作用[D]. 缪琳.中国科学技术大学 2010



本文编号：3465107