四个新的鸽β-防御素抗新城疫病毒作用机制的初步研究

发布时间：2021-11-06 16:21

　　禽β-防御素（AvBDs）是一类广泛存在于禽体内的内源性阳离子抗菌肽,主要特征结构是含有6个半胱氨酸残基构成的3对二硫键。抗菌肽是机体防御微生物入侵体内的第一道屏障。具有广谱抗菌、抗病毒、抗真菌的生物学作用,在禽类的先天性免疫系统中发挥重要作用。本研究运用基因克隆的方法,分别从鸽的骨髓、法氏囊、骨髓和肝脏组织中扩增到4个新的鸽p-防御素基因。将推导的氨基酸序列与相关的p-防御素的氨基酸序列同源性比较分析,将其分别命名为鸽β-防御素1（AvBD1）、鸽β-防御素2（AvBD2）、鸽β-防御素7（AvBD7）和鸽β-防御素10（AvBD10）。将得到的序列与已发现的相关的禽防御素及部分哺乳动物序列分析表明：鸽p-防御素1编码区包含198个核苷酸,编码65个氨基酸残基,与鸭β-防御素1氨基酸同源性最高为81.54%；鸽β-防御素2编码区包含195个核苷酸,编码64个氨基酸残基,与火鸡p-防御素2氨基酸同源性最高为85.94%；鸽p-防御素7编码区包含204个核苷酸,编码67个氨基酸残基,与鸡、鸭p-防御素7氨基酸同源性最高为64.71%；鸽p-防御素10编码区包含204个核苷酸,编码67个氨... 

【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校

【文章页数】：72 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 抗菌肽简介
    1.2 防御素的研究进展
        1.2.1 防御素的定义
        1.2.2 防御素的结构特征与分类
        1.2.3 防御素的应用
    1.3 禽AvBDs的研究进展
        1.3.1 禽AvBDs的结构特征
        1.3.2 禽AvBDs重组蛋白的制备
        1.3.3 禽AvBDs的生物学特性
        1.3.4 禽AvBDs的组织分布
        1.3.5 禽AvBDs的诱导表达
    1.4 Toll样受体的研究进展
    1.5 研究目的与意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株及质粒载体
        2.1.2 药品、试剂及配制
        2.1.3 主要仪器
    2.2 鸽β-防御素基因的克隆与序列分析
        2.2.1 实验用动物及组织样品的采集
        2.2.2 组织总RNA的提取
        2.2.3 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)
        2.2.4 RT-PCR产物的回收
        2.2.5 PCR产物的连接
        2.2.6 感受态细胞的制备
        2.2.7 连接产物的转化
        2.2.8 碱裂解法质粒的提取
        2.2.9 重组质粒的PCR鉴定与测序
        2.2.10 基因序列分析及同源性比较
    2.3 重组鸽β-防御素蛋白的原核表达
        2.3.1 原核表达载体的构建
        2.3.2 重组鸽β-防御素蛋白的诱导表达
        2.3.3 重组鸽β-防御素蛋白的纯化
    2.4 重组鸽β-防御素蛋白的抗菌活性测定
    2.5 不同NaCl浓度对鸽β-防御素重组蛋白抗菌活性影响
    2.6 重组鸽β-防御素蛋白的溶血试验
    2.7 重组鸽β-防御素蛋白体外抗病毒活性的测定
        2.7.1 毒株及实验动物
        2.7.2 鸡胚接种实验
        2.7.3 病毒TCID50测定
    2.8 检测鸽β-防御素及TLRs经新城疫病毒诱导后的组织表达差异
        2.8.1 实验用动物及组织样品的采集
        2.8.2 荧光定量引物的设计
        2.8.3 荧光定量标准品的制备
        2.8.4 样品组织cDNA的制备
        2.8.5 鸽AvBDs及TLRs基因的检测
    2.9 数据统计分析
3 结果与分析
    3.1 鸽β-防御素基因的克隆
    3.2 重组质粒的鉴定
    3.3 测序结果及分析
    3.4 鸽β-防御素基因的遗传进化分析
    3.5 重组鸽β-防御素蛋白的原核表达
        3.5.1 表达用重组表达质粒pMD18-T-Pigeon AvBDs鉴定
        3.5.2 重组表达质粒pProEX-pigeon AvBDs的鉴定
        3.5.3 重组鸽β-防御素蛋白的原核表达与纯化
    3.6 重组鸽β-防御素及His标签蛋白的抗菌活性
    3.7 不同NaCl浓度对鸽β-防御素重组蛋白抗菌活性的影响
    3.8 重组鸽β-防御素蛋白的溶血试验
    3.9 重组鸽β-防御素蛋白的抗病毒活性
    3.10 经新城疫病毒诱导后,鸽β-防御素及TLRs在鸽组织器官中表达差异
4 讨论
    4.1 鸽β-防御素基因克隆与遗传进化分析
    4.2 重组鸽β-防御素融合蛋白的原核表达
    4.3 重组鸽β-防御素蛋白的生物学特性
        4.3.1 重组鸽AvBDs及His标签蛋白的抗菌活性
        4.3.2 不同NaCl浓度对鸽AvBDs重组蛋白抗菌活性的影响
        4.3.3 重组鸽β-防御素蛋白的溶血活性
        4.3.4 重组鸽β-防御素蛋白抗病毒活性
    4.4 鸽β-防御素及TLRs经新城疫诱导后的组织表达差异
5 结论
致谢
参考文献
附录
攻读硕士学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]鸽β-防御素5基因克隆及其抗菌活性[J]. 辛胜男,张可心,张名岳,韩宗玺,邵昱昊,刘晓丽,刘胜旺,马得莹.  生物工程学报. 2012(11)
[2]NDV感染的鸡胚成纤维细胞TLR7 mRNA表达的动态变化[J]. 孟巍,刘新雷,王杲强,李广兴,张瑞莉,郑世民.  中国兽医科学. 2012(06)
[3]Toll样受体的研究进展[J]. 何晓霞,白海.  西北国防医学杂志. 2010(06)
[4]Toll样受体与疾病[J]. 沈二霞.  分子诊断与治疗杂志. 2009(04)
[5]维生素D3对丝毛乌骨鸡组织中β-防御素基因的表达调控[J]. 李思明,周定刚.  动物营养学报. 2009(04)
[6]鸡β-防御素-3在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定[J]. 赵绪永,马辉,赵丽,朱礼倩,李清州.  中国预防兽医学报. 2009(01)
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[8]Toll样受体3与自身免疫性疾病[J]. 杨再兴,仲人前.  现代免疫学. 2006(06)
[9]猪β防御素1基因在毕赤酵母中的分泌表达[J]. 姜丽华,卢海蓉,黄德新,易俊波,李凌云,林枫.  生物工程学报. 2006(06)
[10]广西黄鸡β-防御素Gal-4基因的克隆和体内诱导表达[J]. 谢青梅,陈燕珊,马静云,陈俊伟,毕英佐,曹永长.  中国兽医科学. 2006(08)



本文编号：3480144