梅花鹿、水貂、蓝狐及貉—牛异种体细胞核移植技术研究
发布时间：2021-11-07 14:53
为了探索梅花鹿-牛异种体细胞核移植技术，为梅花鹿胚胎工程研究奠定技术基础，本论文对其供核细胞的培养和冷冻保存、受体卵母细胞的体外成熟、显微操作、重组胚胎外培养等技术环节进行了探索研究，并在水貂、蓝狐和貉等毛皮动物上验证了建立的异种体细胞核移植技术体系。主要内容如下：（1）梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞（Ear Skin Fibriblasts，ESF）经组织块法原代培养，利用酶消化时间差与贴壁时间差法处理3～5次纯化，结果显示细胞生长特点为贴壁生长、呈梭形、具伪足，F5代细胞生长曲线呈“潜伏期-对数生长期-停滞期”的模式。DMSO作为抗冻保护剂时，梅花鹿、水貂、蓝狐和貉ESF解冻复苏后复苏率分别为89.64%、92.44、91.24和91.04，显著高于甘油作为抗冻保护剂。结论：梅花鹿、水貂、蓝狐和貉ESF具有典型的皮肤成纤维细胞生长特点，通过酶消化时间与贴壁时间差的方法对其纯化可行，冷冻保存时可采用10%DMSO作为抗冻保护剂。（2）牛卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus Oocyte Complexes，COCs）经22h体外成熟培养之后，LH+FSH和PMSG+HCG组成...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：91 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 绪论
1.1 梅花鹿的繁殖特点及繁育生物技术
1.1.1 梅花鹿的繁殖特点
1.1.2 梅花鹿的繁育生物技术
1.2 水貂、蓝狐及貉的经济价值与繁育生物技术
1.2.1 水貂的经济价值与繁育生物技术
1.2.2 蓝狐和貉的经济价值与繁育生物技术
1.3 异种体细胞核移植技术研究进展
1.3.1 ISCNT 研究历史
1.3.2 ISCNT 关键技术环节
1.3.3 ISCNT 的研究意义
1.3.4 ISCNT 研究存在的问题
1.4 本研究的内容、目的及意义
1.4.1 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞培养及冷冻保存
1.4.2 牛卵母细胞体外成熟培养条件的优化
1.4.3 梅花鹿-牛 ISCNT 技术方法的研究
1.4.4 水貂、蓝狐及貉-牛 ISCNT 胚胎的制备
第二章 供核细胞培养及冷冻保存
2.1 材料和方法
2.1.1 材料
2.1.2 方法
2.1.3 试验设计
2.1.4 统计分析
2.2 结果与分析
2.2.1 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞的生长特性
2.2.3 DMSO 和甘油对不同供核细胞的冷冻保护效果
2.3 讨论
2.3.1 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞的培养
2.3.2 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞的纯化
2.3.3 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞的冷冻保存
2.4 小结
第三章 牛卵母细胞体外成熟体系的优化
3.1 材料和方法
3.1.1 材料
3.1.2 方法
3.1.3 测定指标与评定方法
3.1.4 统计分析
3.2 结果与分析
3.2.1 不同激素组合对牛卵母细胞体外成熟的影响
3.2.2 BCB 染色优选牛卵母细胞体外成熟
3.2.3 EGF 对牛卵母细胞体外成熟的影响
3.3 讨论
3.3.1 激素对牛卵母细胞体外成熟的影响
3.3.2 BCB 染色对牛卵母细胞体外成熟的作用
3.3.3 EGF 对牛卵母细胞体外成熟的影响
3.4 小结
第四章 梅花鹿-牛 ISCNT 技术研究
4.1 材料和方法
4.1.1 材料
4.1.2 方法
4.1.4 统计分析
4.2 结果与分析
4.2.1 DEME 诱导牛卵母细胞显核的研究
4.2.2 梅花鹿-牛 ISCNT 显微操作的研究
4.2.3 梅花鹿-牛 ISCNT 胚胎体外培养的研究
4.3 讨论
4.3.1 DEME 处理对牛卵母细胞显核的影响
4.3.2 梅花鹿-牛 ISCNT 显微操作
4.3.3 梅花鹿-牛 ISCNT 胚胎体外培养
4.4 小结
第五章 水貂、蓝狐及貉-牛 ISCNT 胚胎的制备
5.1 材料和方法
5.1.1 材料
5.1.2 方法
5.1.3 试验设计
5.1.4 统计分析
5.2 结果与分析
5.2.1 供核细胞对全细胞胞质内注射制备 ISCNT 胚胎的影响
5.2.2 共培养对毛皮动物-牛 ISCNT 胚胎体外发育的影响
5.3 讨论
5.3.1 供核细胞对全细胞胞质内注射制备 ISCNT 胚胎的影响
5.3.2 共培养对水貂、蓝狐及貉-牛 ISCNT 胚胎体外发育的影响
5.4 小结
第六章 全文结论
6.1 结论
6.2 研究的创新点
6.3 后续研究工作
参考文献
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]间情期水貂腔前卵泡卵母细胞的超微结构[J]. 崔凯,梁玉颖,马泽芳. 畜牧兽医学报. 2013(08)
[2]牛卵母细胞体外成熟技术研究进展[J]. 贾振伟,田见晖,安磊,张家新. 中国农业科学. 2013(08)
[3]激素对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响[J]. 马红,付博,仁亮,李忠秋,刘娣. 畜牧与兽医. 2013(04)
[4]核移植中卵母细胞激活方法的研究进展[J]. 王爱萍. 湖北畜牧兽医. 2013(04)
[5]不同方法处理供核细胞对细胞周期和重构胚发育的影响[J]. 蔡琳琳,阮井玲,王娟,曲立娟,李华,黄英. 生命科学研究. 2012(02)
[6]发情期蓝狐卵泡发育的显微结构观察[J]. 田明宇,崔凯,马泽芳,梁玉颖,李延鹏,高善颂,牛树田,王海涛,梁俊文,杨淑慧. 安徽农业科学. 2011(33)
[7]水貂及其经济价值[J]. 李艳丽,冯艳忠. 黑龙江畜牧兽医. 2011(12)
[8]化学辅助去核法对延边黄牛卵母细胞去核率及其重构胚发育率的影响[J]. 王玉涵,朱玉霞,尹多,李钟淑,方南洙. 江西农业大学学报. 2011(02)
[9]梅花鹿良种繁育技术研究[J]. 鞠贵春,王丽丽,张辉. 吉林中医药. 2011(03)
[10]梅花鹿新鲜和冷冻胚胎移植技术的研究[J]. 王梁,史文清,史建民,朱士恩,刘国世. 中国畜牧杂志. 2010(15)
博士论文
[1]白藜芦醇通过调节抗氧化酶活性而呈现抗肿瘤效应[D]. 阿萨（Md.Asaduzzaman Khan）.中南大学 2013
硕士论文
[1]PMSG对性成熟前小鼠卵泡发育的影响及牛卵母细胞体外培养技术研究[D]. 孙健.西北农林科技大学 2009
[2]麋鹿皮肤成纤维细胞的分离培养与细胞周期同步化研究[D]. 赵雪萍.南京农业大学 2006
[3]影响绵、山羊体外胚胎生产主要因素的研究[D]. 卫恒习.河北农业大学 2005
[4]东北梅花鹿卵巢中卵泡发育的组织学研究[D]. 郑丁团.东北林业大学 2005
[5]鹿卵母细胞体外成熟与体外受精的研究[D]. 崔凯.东北林业大学 2004
[6]黇鹿和牧羊犬皮肤细胞的分离与培养研究[D]. 王启凤.南京农业大学 2003
[7]蓝白花肉牛皮肤成纤维细胞的培养及培养条件研究[D]. 张琦.西北农林科技大学 2003
本文编号：3482053
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：91 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 绪论
1.1 梅花鹿的繁殖特点及繁育生物技术
1.1.1 梅花鹿的繁殖特点
1.1.2 梅花鹿的繁育生物技术
1.2 水貂、蓝狐及貉的经济价值与繁育生物技术
1.2.1 水貂的经济价值与繁育生物技术
1.2.2 蓝狐和貉的经济价值与繁育生物技术
1.3 异种体细胞核移植技术研究进展
1.3.1 ISCNT 研究历史
1.3.2 ISCNT 关键技术环节
1.3.3 ISCNT 的研究意义
1.3.4 ISCNT 研究存在的问题
1.4 本研究的内容、目的及意义
1.4.1 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞培养及冷冻保存
1.4.2 牛卵母细胞体外成熟培养条件的优化
1.4.3 梅花鹿-牛 ISCNT 技术方法的研究
1.4.4 水貂、蓝狐及貉-牛 ISCNT 胚胎的制备
第二章 供核细胞培养及冷冻保存
2.1 材料和方法
2.1.1 材料
2.1.2 方法
2.1.3 试验设计
2.1.4 统计分析
2.2 结果与分析
2.2.1 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞的生长特性
2.2.3 DMSO 和甘油对不同供核细胞的冷冻保护效果
2.3 讨论
2.3.1 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞的培养
2.3.2 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞的纯化
2.3.3 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞的冷冻保存
2.4 小结
第三章 牛卵母细胞体外成熟体系的优化
3.1 材料和方法
3.1.1 材料
3.1.2 方法
3.1.3 测定指标与评定方法
3.1.4 统计分析
3.2 结果与分析
3.2.1 不同激素组合对牛卵母细胞体外成熟的影响
3.2.2 BCB 染色优选牛卵母细胞体外成熟
3.2.3 EGF 对牛卵母细胞体外成熟的影响
3.3 讨论
3.3.1 激素对牛卵母细胞体外成熟的影响
3.3.2 BCB 染色对牛卵母细胞体外成熟的作用
3.3.3 EGF 对牛卵母细胞体外成熟的影响
3.4 小结
第四章 梅花鹿-牛 ISCNT 技术研究
4.1 材料和方法
4.1.1 材料
4.1.2 方法
4.1.4 统计分析
4.2 结果与分析
4.2.1 DEME 诱导牛卵母细胞显核的研究
4.2.2 梅花鹿-牛 ISCNT 显微操作的研究
4.2.3 梅花鹿-牛 ISCNT 胚胎体外培养的研究
4.3 讨论
4.3.1 DEME 处理对牛卵母细胞显核的影响
4.3.2 梅花鹿-牛 ISCNT 显微操作
4.3.3 梅花鹿-牛 ISCNT 胚胎体外培养
4.4 小结
第五章 水貂、蓝狐及貉-牛 ISCNT 胚胎的制备
5.1 材料和方法
5.1.1 材料
5.1.2 方法
5.1.3 试验设计
5.1.4 统计分析
5.2 结果与分析
5.2.1 供核细胞对全细胞胞质内注射制备 ISCNT 胚胎的影响
5.2.2 共培养对毛皮动物-牛 ISCNT 胚胎体外发育的影响
5.3 讨论
5.3.1 供核细胞对全细胞胞质内注射制备 ISCNT 胚胎的影响
5.3.2 共培养对水貂、蓝狐及貉-牛 ISCNT 胚胎体外发育的影响
5.4 小结
第六章 全文结论
6.1 结论
6.2 研究的创新点
6.3 后续研究工作
参考文献
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]间情期水貂腔前卵泡卵母细胞的超微结构[J]. 崔凯,梁玉颖,马泽芳. 畜牧兽医学报. 2013(08)
[2]牛卵母细胞体外成熟技术研究进展[J]. 贾振伟,田见晖,安磊,张家新. 中国农业科学. 2013(08)
[3]激素对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响[J]. 马红,付博,仁亮,李忠秋,刘娣. 畜牧与兽医. 2013(04)
[4]核移植中卵母细胞激活方法的研究进展[J]. 王爱萍. 湖北畜牧兽医. 2013(04)
[5]不同方法处理供核细胞对细胞周期和重构胚发育的影响[J]. 蔡琳琳,阮井玲,王娟,曲立娟,李华,黄英. 生命科学研究. 2012(02)
[6]发情期蓝狐卵泡发育的显微结构观察[J]. 田明宇,崔凯,马泽芳,梁玉颖,李延鹏,高善颂,牛树田,王海涛,梁俊文,杨淑慧. 安徽农业科学. 2011(33)
[7]水貂及其经济价值[J]. 李艳丽,冯艳忠. 黑龙江畜牧兽医. 2011(12)
[8]化学辅助去核法对延边黄牛卵母细胞去核率及其重构胚发育率的影响[J]. 王玉涵,朱玉霞,尹多,李钟淑,方南洙. 江西农业大学学报. 2011(02)
[9]梅花鹿良种繁育技术研究[J]. 鞠贵春,王丽丽,张辉. 吉林中医药. 2011(03)
[10]梅花鹿新鲜和冷冻胚胎移植技术的研究[J]. 王梁,史文清,史建民,朱士恩,刘国世. 中国畜牧杂志. 2010(15)
博士论文
[1]白藜芦醇通过调节抗氧化酶活性而呈现抗肿瘤效应[D]. 阿萨（Md.Asaduzzaman Khan）.中南大学 2013
硕士论文
[1]PMSG对性成熟前小鼠卵泡发育的影响及牛卵母细胞体外培养技术研究[D]. 孙健.西北农林科技大学 2009
[2]麋鹿皮肤成纤维细胞的分离培养与细胞周期同步化研究[D]. 赵雪萍.南京农业大学 2006
[3]影响绵、山羊体外胚胎生产主要因素的研究[D]. 卫恒习.河北农业大学 2005
[4]东北梅花鹿卵巢中卵泡发育的组织学研究[D]. 郑丁团.东北林业大学 2005
[5]鹿卵母细胞体外成熟与体外受精的研究[D]. 崔凯.东北林业大学 2004
[6]黇鹿和牧羊犬皮肤细胞的分离与培养研究[D]. 王启凤.南京农业大学 2003
[7]蓝白花肉牛皮肤成纤维细胞的培养及培养条件研究[D]. 张琦.西北农林科技大学 2003
本文编号：3482053
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