猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法的建立与应用
发布时间：2021-11-10 19:11
巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌分别是引起猪巴氏杆菌病、猪链球菌病、猪支原体肺炎、猪传染性胸膜肺炎和格拉瑟氏病的主要病原,也是当前养猪业常见的五种呼吸系统疾病病原菌。这五种病原菌均可引起猪的呼吸道疾病,且引起的临床症状和病理变化通过肉眼观察有时难以区分。有时还存在这几种病原菌混合感染的情况,更给疾病的诊断造成困难。为了有效鉴定这些病原菌,本课题拟建立一种同时鉴定这五种病原的PCR诊断方法。1.猪呼吸系统病原菌单重PCR检测方法的建立目的:建立猪呼吸系统病原菌的单重PCR检测方法。方法:针对巴氏杆菌plpE基因、猪链球菌gdh基因、猪肺炎支原体mhp677基因、胸膜肺炎放线杆菌apxⅣ基因和副猪嗜血杆菌vanY基因序列各设计1对引物,确定每种病原单重PCR的退火温度和敏感性,验证引物的特异性。结果:确定五种病原单重PCR扩增的退火温度范围为54℃-60℃,每对引物均为相应病原菌特异的引物。plpE基因的最低检出限为0.01 ng/μL,gdh基因的最低检出限为0.1 ng/μL,mhp677基因的最检出限为0.1 ng/μL,apxⅣ基因的最低检出限为0....
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
使用不同的退火温度扩增巴氏杆菌plpE基因片段
第3章猪呼吸系统病原菌单重PCR检测方法的建立31图3.2使用不同的退火温度扩增猪链球菌gdh基因片段Fig3.2AmplificationofS.suisgdhgenefragmentatdifferentannealingtemperatures.M：DL2000DNAMarker；泳道1-8的退火温度：30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃、66℃、72℃。M:DL2000DNAMarker;Annealingtemperaturesinlane1-8:30℃,36℃,42℃,48℃,54℃,60℃,66℃,72℃.3.3.1.3猪肺炎支原体mhp677基因片段退火温度的确定分别以30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃、66℃、72℃的退火温度扩增mhp677基因片段。在退火温度为30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃时，扩增出一条与目的片段大小相同的526bp的条带；在退火温度为66℃和72℃时，没有条带扩增出来。将与目的片段大小相同的扩增条带测序后，与目的基因进行核苷酸序列比对，二者核苷酸序列相同，即扩增的与目的片段大小相同的条带为目的条带。根据PCR扩增结果和核苷酸测序结果可知，扩增mhp677基因片段的退火温度范围为30℃-60℃。图3.3使用不同的退火温度扩增猪肺炎支原体mhp677基因片段Fig3.3AmplificationofM.hyopneumonaiemhp677genefragmentatdifferentannealingtemperatures.M：DL2000DNAMarker；泳道1-8的退火温度：30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃、66℃、72℃。
第3章猪呼吸系统病原菌单重PCR检测方法的建立31图3.2使用不同的退火温度扩增猪链球菌gdh基因片段Fig3.2AmplificationofS.suisgdhgenefragmentatdifferentannealingtemperatures.M：DL2000DNAMarker；泳道1-8的退火温度：30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃、66℃、72℃。M:DL2000DNAMarker;Annealingtemperaturesinlane1-8:30℃,36℃,42℃,48℃,54℃,60℃,66℃,72℃.3.3.1.3猪肺炎支原体mhp677基因片段退火温度的确定分别以30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃、66℃、72℃的退火温度扩增mhp677基因片段。在退火温度为30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃时，扩增出一条与目的片段大小相同的526bp的条带；在退火温度为66℃和72℃时，没有条带扩增出来。将与目的片段大小相同的扩增条带测序后，与目的基因进行核苷酸序列比对，二者核苷酸序列相同，即扩增的与目的片段大小相同的条带为目的条带。根据PCR扩增结果和核苷酸测序结果可知，扩增mhp677基因片段的退火温度范围为30℃-60℃。图3.3使用不同的退火温度扩增猪肺炎支原体mhp677基因片段Fig3.3AmplificationofM.hyopneumonaiemhp677genefragmentatdifferentannealingtemperatures.M：DL2000DNAMarker；泳道1-8的退火温度：30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃、66℃、72℃。
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪多杀性巴氏杆菌病预防与临床诊治[J]. 罗俊,彭宇,廖森林,张天涛,吴元浩,邬旭龙. 猪业科学. 2020(04)
[2]猪链球菌病实验室检测技术研究进展[J]. 杨慧敏,樊明明,吕玉金. 现代牧业. 2019(04)
[3]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立及应用[J]. 杨永能. 中国猪业. 2019(06)
[4]猪链球菌微滴数字PCR定量检测方法的建立[J]. 石磊,温雯,陈洵,叶蕾,常彦磊,李丽丽. 现代食品科技. 2019(01)
[5]副猪嗜血杆菌微滴数字PCR定量检测方法的建立[J]. 石磊,温雯,李丽丽. 现代食品科技. 2018(12)
[6]猪链球菌毒力因子研究新进展[J]. 张海燕,黎婷,张冬冬,萧晟. 芜湖职业技术学院学报. 2018(03)
[7]副猪嗜血杆菌血清13型分离鉴定及其培养特性研究[J]. 庞琳琳,赵秋华,王欣,张俊杰,郭爽,李蓓蓓,刘珂,邵东华,邱亚峰,马志永,王建,魏建超. 中国动物传染病学报. 2019(05)
[8]副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立及应用[J]. 梁乔,杨本勇,石霖,李井春,张健,赵凤菊. 现代畜牧兽医. 2018(09)
[9]7种猪呼吸道综合征疾病病原多重PCR方法的建立[J]. 任梅渗,冷依伊,蒙正群,张鹏飞,杨泽晓,姚学萍,王印. 中国农业大学学报. 2017(07)
[10]猪链球菌病的研究进展[J]. 浦坚华,毛紫微,王琼. 上海畜牧兽医通讯. 2016(04)
博士论文
[1]猪肺炎支原体和猪鼻支原体的基因组测序与比较基因组学分析[D]. 刘威.华中农业大学 2014
[2]胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌基因芯片检测与分型研究[D]. 肖国生.四川农业大学 2006
硕士论文
[1]猪链球菌多重PCR检测方法的建立及试剂盒研制[D]. 马烨.南京农业大学 2017
[2]猪的三种常见呼吸道细菌多重PCR检测方法的建立[D]. 孙学飞.安徽农业大学 2016
[3]猪多杀性巴氏杆菌PlpB与Fur基因融合表达及免疫效果评价[D]. 蒋惠婷.黑龙江八一农垦大学 2014
[4]牛源A型多杀性巴氏杆菌plpE基因的克隆表达及DNA疫苗的研究[D]. 黄园媛.西南大学 2013
[5]猪多杀性巴氏杆菌分离鉴定及其PMT毒素免疫原性研究[D]. 张军虎.华中农业大学 2011
[6]副猪嗜血杆菌，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌2型三重PCR方法的建立与应用[D]. 张仁良.南京农业大学 2011
[7]重组多杀性巴氏杆菌细菌幽灵的研究[D]. 刘东胜.南昌大学 2008
[8]兔多杀性巴氏杆菌铁调节外膜蛋白的免疫原性、表位及耐药性的分析[D]. 顾宏伟.南京农业大学 2004
本文编号：3487789
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
使用不同的退火温度扩增巴氏杆菌plpE基因片段
第3章猪呼吸系统病原菌单重PCR检测方法的建立31图3.2使用不同的退火温度扩增猪链球菌gdh基因片段Fig3.2AmplificationofS.suisgdhgenefragmentatdifferentannealingtemperatures.M：DL2000DNAMarker；泳道1-8的退火温度：30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃、66℃、72℃。M:DL2000DNAMarker;Annealingtemperaturesinlane1-8:30℃,36℃,42℃,48℃,54℃,60℃,66℃,72℃.3.3.1.3猪肺炎支原体mhp677基因片段退火温度的确定分别以30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃、66℃、72℃的退火温度扩增mhp677基因片段。在退火温度为30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃时，扩增出一条与目的片段大小相同的526bp的条带；在退火温度为66℃和72℃时，没有条带扩增出来。将与目的片段大小相同的扩增条带测序后，与目的基因进行核苷酸序列比对，二者核苷酸序列相同，即扩增的与目的片段大小相同的条带为目的条带。根据PCR扩增结果和核苷酸测序结果可知，扩增mhp677基因片段的退火温度范围为30℃-60℃。图3.3使用不同的退火温度扩增猪肺炎支原体mhp677基因片段Fig3.3AmplificationofM.hyopneumonaiemhp677genefragmentatdifferentannealingtemperatures.M：DL2000DNAMarker；泳道1-8的退火温度：30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃、66℃、72℃。
第3章猪呼吸系统病原菌单重PCR检测方法的建立31图3.2使用不同的退火温度扩增猪链球菌gdh基因片段Fig3.2AmplificationofS.suisgdhgenefragmentatdifferentannealingtemperatures.M：DL2000DNAMarker；泳道1-8的退火温度：30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃、66℃、72℃。M:DL2000DNAMarker;Annealingtemperaturesinlane1-8:30℃,36℃,42℃,48℃,54℃,60℃,66℃,72℃.3.3.1.3猪肺炎支原体mhp677基因片段退火温度的确定分别以30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃、66℃、72℃的退火温度扩增mhp677基因片段。在退火温度为30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃时，扩增出一条与目的片段大小相同的526bp的条带；在退火温度为66℃和72℃时，没有条带扩增出来。将与目的片段大小相同的扩增条带测序后，与目的基因进行核苷酸序列比对，二者核苷酸序列相同，即扩增的与目的片段大小相同的条带为目的条带。根据PCR扩增结果和核苷酸测序结果可知，扩增mhp677基因片段的退火温度范围为30℃-60℃。图3.3使用不同的退火温度扩增猪肺炎支原体mhp677基因片段Fig3.3AmplificationofM.hyopneumonaiemhp677genefragmentatdifferentannealingtemperatures.M：DL2000DNAMarker；泳道1-8的退火温度：30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃、66℃、72℃。
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪多杀性巴氏杆菌病预防与临床诊治[J]. 罗俊,彭宇,廖森林,张天涛,吴元浩,邬旭龙. 猪业科学. 2020(04)
[2]猪链球菌病实验室检测技术研究进展[J]. 杨慧敏,樊明明,吕玉金. 现代牧业. 2019(04)
[3]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立及应用[J]. 杨永能. 中国猪业. 2019(06)
[4]猪链球菌微滴数字PCR定量检测方法的建立[J]. 石磊,温雯,陈洵,叶蕾,常彦磊,李丽丽. 现代食品科技. 2019(01)
[5]副猪嗜血杆菌微滴数字PCR定量检测方法的建立[J]. 石磊,温雯,李丽丽. 现代食品科技. 2018(12)
[6]猪链球菌毒力因子研究新进展[J]. 张海燕,黎婷,张冬冬,萧晟. 芜湖职业技术学院学报. 2018(03)
[7]副猪嗜血杆菌血清13型分离鉴定及其培养特性研究[J]. 庞琳琳,赵秋华,王欣,张俊杰,郭爽,李蓓蓓,刘珂,邵东华,邱亚峰,马志永,王建,魏建超. 中国动物传染病学报. 2019(05)
[8]副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立及应用[J]. 梁乔,杨本勇,石霖,李井春,张健,赵凤菊. 现代畜牧兽医. 2018(09)
[9]7种猪呼吸道综合征疾病病原多重PCR方法的建立[J]. 任梅渗,冷依伊,蒙正群,张鹏飞,杨泽晓,姚学萍,王印. 中国农业大学学报. 2017(07)
[10]猪链球菌病的研究进展[J]. 浦坚华,毛紫微,王琼. 上海畜牧兽医通讯. 2016(04)
博士论文
[1]猪肺炎支原体和猪鼻支原体的基因组测序与比较基因组学分析[D]. 刘威.华中农业大学 2014
[2]胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌基因芯片检测与分型研究[D]. 肖国生.四川农业大学 2006
硕士论文
[1]猪链球菌多重PCR检测方法的建立及试剂盒研制[D]. 马烨.南京农业大学 2017
[2]猪的三种常见呼吸道细菌多重PCR检测方法的建立[D]. 孙学飞.安徽农业大学 2016
[3]猪多杀性巴氏杆菌PlpB与Fur基因融合表达及免疫效果评价[D]. 蒋惠婷.黑龙江八一农垦大学 2014
[4]牛源A型多杀性巴氏杆菌plpE基因的克隆表达及DNA疫苗的研究[D]. 黄园媛.西南大学 2013
[5]猪多杀性巴氏杆菌分离鉴定及其PMT毒素免疫原性研究[D]. 张军虎.华中农业大学 2011
[6]副猪嗜血杆菌，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌2型三重PCR方法的建立与应用[D]. 张仁良.南京农业大学 2011
[7]重组多杀性巴氏杆菌细菌幽灵的研究[D]. 刘东胜.南昌大学 2008
[8]兔多杀性巴氏杆菌铁调节外膜蛋白的免疫原性、表位及耐药性的分析[D]. 顾宏伟.南京农业大学 2004
本文编号：3487789
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