肠毒素大肠杆菌K88生物探针制备及其快速检测分析技术研究
发布时间：2021-11-11 10:48
肠毒素大肠杆菌K88（ETEC K88）是一种常见的肠道微生物,也是引起仔猪腹泻和死亡的主要致病微生物。养殖业中准确、低成本、简便、快速地找出引起仔猪腹泻的原因及微生物的种类甚至是血清型一直是一个难以攻克的难题,一些很好的生物产品如疫苗、卵黄抗体等也因此在仔猪疾病预防和治疗中的不能大规模低成本应用。建立和完善针对于ETEC K88的低成本、简便、快速分析检测体系并实现在养殖业中的商业化应用是降低这一类致病微生物引起的仔猪死亡的重要手段。本文以ETEC K88为目标模式菌,利用生物学方法筛选和制备以K88菌毛蛋白为靶标的单克隆抗体和适配体、以ETEC K88菌体为靶标的细胞适配体和适配体文库,鉴定了它们与靶标的结合性能,初步构建了基于这几种生物探针的检测体系分别用于K88菌毛蛋白和ETEC K88菌体的快速检测分析。同时,成功建立了一个新的FluMag-Cell-SELEX （FluMag Cell systematic evolution of ligands by exponential enrichment）细胞适配体筛选方法。实验结果如下：本文优化了ETEC K88的发酵工艺,在...
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：133 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 引言与文献综述
1.1 肠毒素大肠杆菌ETEC K88
1.1.1 大肠杆菌
1.1.2 肠毒素大肠杆菌(ETEC)
1.1.3 ETEC菌毛
1.1.4 ETEC K88和K88菌毛
1.2 大肠杆菌引起的仔猪腹泻
1.2.1 仔猪黄痢
1.2.2 仔猪白痢
1.2.3 断奶仔猪腹泻
1.3 大肠杆菌的检测方法
1.3.1 标准检测方法和血清型鉴定
1.3.2 新型快速检测方法
1.4 用于大肠杆菌检测的生物探针
1.4.1 核酸(DNA)探针
1.4.2 抗体探针
1.4.3 适配体探针
1.5 适配体
1.5.1 适配体与靶目标的结合
1.5.2 适配体的筛选(SELEX技术)
1.5.3 适配体作为探针与抗体的比较优势
1.6 本课题研究的工作思路和主要内容
第二章 K88菌毛蛋白的提取纯化和单克隆抗体的制备
2.1 实验仪器与材料
2.1.1 主要仪器
2.1.2 菌种和培养基
2.1.3 实验动物及细胞
2.1.4 主要试剂配制
2.1.5 其他试剂
2.2 实验方法
2.2.1 ETEC K88菌毛蛋白的制备
2.2.2 ETEC K88菌毛蛋白的单克隆抗体制备
2.2.3 K88菌毛蛋白单克隆抗体生物素标记及Western Blot鉴定
2.2.4 K88菌毛蛋白单克隆抗体亲和力测定
2.2.5 K88菌毛蛋白单克隆抗体效价测定
2.2.6 K88菌毛蛋白单克隆抗体与ETEC K88的结合性能分析
2.2.7 K88菌毛蛋白单克隆抗体与ETEC K88的结合特异性分析
2.2.8 基于K88菌毛蛋白单克隆抗体的ABS-ELISA体系对K88菌毛蛋白的检测灵敏度分析
2.3 实验结果与讨论
2.3.1 ETEC K88菌毛蛋白的制备
2.3.2 ETEC K88菌毛蛋白单克隆抗体的筛选和制备
2.3.3 K88菌毛蛋白单克隆抗体效价测定
2.3.4 K88菌毛蛋白单克隆抗体的亲和力测定
2.3.5 K88菌毛蛋白单克隆抗体与ETEC K88的结合性能分析
2.3.6 K88菌毛蛋白单克隆抗体与ETEC K88的结合特异性分析
2.3.7 基于K88菌毛蛋白单克隆抗体的ABS-ELISA体系检测ETECK88菌毛蛋白的灵敏度分析
2.4 讨论和小结
第三章 EIECK88菌毛蛋白适配体的筛选、鉴定及利用Aptamer-ABS-ELISA方法快速分析ETEC K88菌毛蛋白
3.1 实验仪器与材料
3.1.1 主要仪器
3.1.2 菌种和培养基
3.1.3 主要试剂配制
3.1.4 其他试剂
3.1.5 随机SSDNA文库的构建以及引物合成
3.1.6 适配体的合成和修饰
3.2 实验方法
3.2.1 细菌的准备和稀释平板菌落计数(MPN)
3.2.2 ETEC K88菌毛蛋白的制备
3.2.3 SELEX过程
3.2.4 胶回收纯化ssDNA文库
3.2.5 富集文库与K88菌毛蛋白的结合率分析
3.2.6 测序
3.2.7 克隆序列分析及二级结构预测
3.2.8 K88菌毛蛋白适配体亲和力测定
3.2.9 K88菌毛蛋白适配体和ETEC K88的结合性能分析
3.2.10 K88菌毛蛋白适配体与ETEC K88的结合特异性分析
3.2.11 基于适配体的Aptamer-ABS-ELISA法检测ETEC K88菌毛蛋白体系检测ETEC K88的灵敏度分析
3.3 实验结果
3.3.1 富集文库与K88菌毛蛋白的结合率分析
3.3.2 克隆序列一级结构序列同源性分析
3.3.3 候选适配体二级结构预测
3.3.4 候选K88菌毛蛋白适配体与ETEC K88的结合性能分析
3.3.5 K88菌毛蛋白适配体亲和力测定
3.3.6 K88菌毛蛋白适配体和ETEC K88的结合性能分析
3.3.7 K88菌毛蛋白适配体与ETEC K88的结合特异性分析
3.3.8 基于K88菌毛蛋白适配体的APTAMER-ABS-ELISA法检测ETEC K88菌毛蛋白体系的灵敏度分析
3.4 讨论和小结
第四章 不同CELL-SELEX技术筛选ETEC K88细胞适配体
4.1 实验仪器与材料
4.1.1 主要仪器
4.1.2 菌种和培养基
4.1.3 主要试剂配制
4.1.4 其他试剂
4.1.5 随机SSDNA文库的构建以及引物合成
4.1.6 适配体的合成和修饰
4.2 实验方法
4.2.1 细菌的准备和稀释平板菌落计数(MPN)
4.2.2 经典CELL-SELEX过程(离心分离法)
4.2.3 荧光磁珠法CELL-SELEX(FLUMAG-CELL-SELEX)过程
4.2.4 SSDNA文库的胶回收和纯化
4.2.5 反筛(COUNTER-SELEX)
4.2.6 富集文库与K88菌毛蛋白的结合率分析
4.2.7 测序
4.2.8 克隆序列分析及二级结构预测
4.2.9 K88免疫磁珠(K88 IMB)的可靠性研究
4.3 实验结果
4.3.1 K88 IMB的可靠性研究
4.3.2 经典SELEX技术筛选ETEC K88细胞适配体
4.3.3 FLUMAG-CELL-SELEX技术筛选ETEC K88细胞适配体
4.3.4 两种SELEX技术筛选ETEC K88细胞适配体对比
4.4 讨论和小结
第五章 基于细胞适配体/细胞适配体文库直接荧光探针分析与免疫磁分离技术相结合快速检测ETEC K88研究
5.1 实验仪器与材料
5.1.1 主要仪器
5.1.2 菌种和培养基
5.1.3 主要试剂配制
5.1.4 其他试剂
5.1.5 适配体的合成和修饰
5.2 实验方法
5.2.1 细菌的准备和稀释平板菌落计数(MPN)
5.2.2 FITC修饰的适配体文库的扩增
5.2.3 ETEC K88细胞适配体亲和力测定
5.2.4 ETEC K88细胞适配体和细胞适配体文库(Aptamer library)与ETEC K88的结合性能分析
5.2.5 基于细胞适配体/适配体文库的直接荧光分析法-IMS技术相结合快速分析检测ETEC K88
5.3 实验结果
5.3.1 ETEC K88细胞适配体亲和力测定
5.3.2 ETEC K88细胞适配体和细胞适配体文库与ETEC K88的结合性能分析
5.3.3 基于细胞适配体/适配体文库的直接荧光探针分析-IMS技术相结合快速分析检测ETEC K88
5.4 讨论和小结
第六章 结论和展望
6.1 结论
6.2 展望
参考文献
攻读博士学位期间撰写、发表的学术论文
致谢
本文编号：3488723
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：133 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 引言与文献综述
1.1 肠毒素大肠杆菌ETEC K88
1.1.1 大肠杆菌
1.1.2 肠毒素大肠杆菌(ETEC)
1.1.3 ETEC菌毛
1.1.4 ETEC K88和K88菌毛
1.2 大肠杆菌引起的仔猪腹泻
1.2.1 仔猪黄痢
1.2.2 仔猪白痢
1.2.3 断奶仔猪腹泻
1.3 大肠杆菌的检测方法
1.3.1 标准检测方法和血清型鉴定
1.3.2 新型快速检测方法
1.4 用于大肠杆菌检测的生物探针
1.4.1 核酸(DNA)探针
1.4.2 抗体探针
1.4.3 适配体探针
1.5 适配体
1.5.1 适配体与靶目标的结合
1.5.2 适配体的筛选(SELEX技术)
1.5.3 适配体作为探针与抗体的比较优势
1.6 本课题研究的工作思路和主要内容
第二章 K88菌毛蛋白的提取纯化和单克隆抗体的制备
2.1 实验仪器与材料
2.1.1 主要仪器
2.1.2 菌种和培养基
2.1.3 实验动物及细胞
2.1.4 主要试剂配制
2.1.5 其他试剂
2.2 实验方法
2.2.1 ETEC K88菌毛蛋白的制备
2.2.2 ETEC K88菌毛蛋白的单克隆抗体制备
2.2.3 K88菌毛蛋白单克隆抗体生物素标记及Western Blot鉴定
2.2.4 K88菌毛蛋白单克隆抗体亲和力测定
2.2.5 K88菌毛蛋白单克隆抗体效价测定
2.2.6 K88菌毛蛋白单克隆抗体与ETEC K88的结合性能分析
2.2.7 K88菌毛蛋白单克隆抗体与ETEC K88的结合特异性分析
2.2.8 基于K88菌毛蛋白单克隆抗体的ABS-ELISA体系对K88菌毛蛋白的检测灵敏度分析
2.3 实验结果与讨论
2.3.1 ETEC K88菌毛蛋白的制备
2.3.2 ETEC K88菌毛蛋白单克隆抗体的筛选和制备
2.3.3 K88菌毛蛋白单克隆抗体效价测定
2.3.4 K88菌毛蛋白单克隆抗体的亲和力测定
2.3.5 K88菌毛蛋白单克隆抗体与ETEC K88的结合性能分析
2.3.6 K88菌毛蛋白单克隆抗体与ETEC K88的结合特异性分析
2.3.7 基于K88菌毛蛋白单克隆抗体的ABS-ELISA体系检测ETECK88菌毛蛋白的灵敏度分析
2.4 讨论和小结
第三章 EIECK88菌毛蛋白适配体的筛选、鉴定及利用Aptamer-ABS-ELISA方法快速分析ETEC K88菌毛蛋白
3.1 实验仪器与材料
3.1.1 主要仪器
3.1.2 菌种和培养基
3.1.3 主要试剂配制
3.1.4 其他试剂
3.1.5 随机SSDNA文库的构建以及引物合成
3.1.6 适配体的合成和修饰
3.2 实验方法
3.2.1 细菌的准备和稀释平板菌落计数(MPN)
3.2.2 ETEC K88菌毛蛋白的制备
3.2.3 SELEX过程
3.2.4 胶回收纯化ssDNA文库
3.2.5 富集文库与K88菌毛蛋白的结合率分析
3.2.6 测序
3.2.7 克隆序列分析及二级结构预测
3.2.8 K88菌毛蛋白适配体亲和力测定
3.2.9 K88菌毛蛋白适配体和ETEC K88的结合性能分析
3.2.10 K88菌毛蛋白适配体与ETEC K88的结合特异性分析
3.2.11 基于适配体的Aptamer-ABS-ELISA法检测ETEC K88菌毛蛋白体系检测ETEC K88的灵敏度分析
3.3 实验结果
3.3.1 富集文库与K88菌毛蛋白的结合率分析
3.3.2 克隆序列一级结构序列同源性分析
3.3.3 候选适配体二级结构预测
3.3.4 候选K88菌毛蛋白适配体与ETEC K88的结合性能分析
3.3.5 K88菌毛蛋白适配体亲和力测定
3.3.6 K88菌毛蛋白适配体和ETEC K88的结合性能分析
3.3.7 K88菌毛蛋白适配体与ETEC K88的结合特异性分析
3.3.8 基于K88菌毛蛋白适配体的APTAMER-ABS-ELISA法检测ETEC K88菌毛蛋白体系的灵敏度分析
3.4 讨论和小结
第四章 不同CELL-SELEX技术筛选ETEC K88细胞适配体
4.1 实验仪器与材料
4.1.1 主要仪器
4.1.2 菌种和培养基
4.1.3 主要试剂配制
4.1.4 其他试剂
4.1.5 随机SSDNA文库的构建以及引物合成
4.1.6 适配体的合成和修饰
4.2 实验方法
4.2.1 细菌的准备和稀释平板菌落计数(MPN)
4.2.2 经典CELL-SELEX过程(离心分离法)
4.2.3 荧光磁珠法CELL-SELEX(FLUMAG-CELL-SELEX)过程
4.2.4 SSDNA文库的胶回收和纯化
4.2.5 反筛(COUNTER-SELEX)
4.2.6 富集文库与K88菌毛蛋白的结合率分析
4.2.7 测序
4.2.8 克隆序列分析及二级结构预测
4.2.9 K88免疫磁珠(K88 IMB)的可靠性研究
4.3 实验结果
4.3.1 K88 IMB的可靠性研究
4.3.2 经典SELEX技术筛选ETEC K88细胞适配体
4.3.3 FLUMAG-CELL-SELEX技术筛选ETEC K88细胞适配体
4.3.4 两种SELEX技术筛选ETEC K88细胞适配体对比
4.4 讨论和小结
第五章 基于细胞适配体/细胞适配体文库直接荧光探针分析与免疫磁分离技术相结合快速检测ETEC K88研究
5.1 实验仪器与材料
5.1.1 主要仪器
5.1.2 菌种和培养基
5.1.3 主要试剂配制
5.1.4 其他试剂
5.1.5 适配体的合成和修饰
5.2 实验方法
5.2.1 细菌的准备和稀释平板菌落计数(MPN)
5.2.2 FITC修饰的适配体文库的扩增
5.2.3 ETEC K88细胞适配体亲和力测定
5.2.4 ETEC K88细胞适配体和细胞适配体文库(Aptamer library)与ETEC K88的结合性能分析
5.2.5 基于细胞适配体/适配体文库的直接荧光分析法-IMS技术相结合快速分析检测ETEC K88
5.3 实验结果
5.3.1 ETEC K88细胞适配体亲和力测定
5.3.2 ETEC K88细胞适配体和细胞适配体文库与ETEC K88的结合性能分析
5.3.3 基于细胞适配体/适配体文库的直接荧光探针分析-IMS技术相结合快速分析检测ETEC K88
5.4 讨论和小结
第六章 结论和展望
6.1 结论
6.2 展望
参考文献
攻读博士学位期间撰写、发表的学术论文
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本文编号：3488723
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