猪E2F3基因3′UTR双荧光素酶报告基因质粒构建及其与miR-10a-5p的靶向验证
发布时间：2021-11-11 14:48
为了鉴定miR-10a-5p与猪E2F3基因的靶向关系,试验从生物信息miRNA Base数据库查询miR-10a-5p的相关信息,并运用MEGA 6.0软件分析其保守性,通过Target Scan生物信息学网站预测其潜在的靶基因及结合位点,然后PCR扩增E2F3基因3′非编码区（3′UTR）片段,构建E2F3的野生型（E2F3-3′UTR-wt）和突变型（E2F3-3′UTR-mut）双荧光素酶报告基因质粒,并分别与miR-10a-5p mimics、mimics NC共转染至293T细胞中,检测双荧光素酶活性变化。结果表明:miR-10a-5p在7个物种间具有高度保守性,成熟序列均为UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGU;Target Scan生物信息学网站预测到miR-10a-5p具有包括E2F3基因在内的共241个潜在的靶基因;E2F3基因片段经PCR扩增获得大小约1 288 bp的清晰条带,测序结果与预期一致;转染miR-10a-5p mimics能显著降低猪E2F3基因野生型质粒双荧光素酶活性（P<0.05）。说明猪E2F3基因3′UTR双荧光素酶报告基因质粒构...
【文章来源】：黑龙江畜牧兽医. 2020,(15)北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
E2F3-3′UTR-mut PCR 鉴定结果
E2Fs基因家族编码的蛋白质可作为促进细胞周期S期进程的一种激活剂,当大多数细胞处于S期和G2期时,E2F3a等活化剂均以蛋白酶体和糖基化依赖性方式降解[13]。E2F3基因作为E2Fs基因家族中的一员,参与多种细胞的增殖、分化[14]、周期和凋亡等过程。如miR-363可以靶向调控E2F3基因,对HepG2细胞的增殖产生抑制作用,并促进其凋亡[15];E2F3基因还能够被miR-152显著下调,抑制肿瘤细胞的增殖[16];并且E2F3基因沉默能促进前列腺癌细胞系的凋亡[17];通过干扰E2F7基因的表达可以极显著促进E2F3的表达(P<0.01),同时极显著促进与成肌细胞增殖相关microRNAs的表达[18]。上述研究结果均表明,E2F3基因对多种细胞的增殖能够起到一定调节作用,但目前关于猪成肌细胞中对E2F3基因作用机制方面的研究报道少见。本试验首先通过生物信息miRNA Base数据库发现miR-10a-5p在多物种之间具有较高的保守性,并预测到E2F3基因存在与miR-10a-5p结合的3′UTR结合位点,推测可能是其靶基因。进一步构建E2F3基因的野生型双荧光素酶报告基因质粒,并通过对预测的结合位点进行定点突变构建突变型双荧光素酶报告基因质粒。将构建的质粒分别与miR-10a-5p mimics和mimics NC共转染至293T细胞中检测荧光素酶活性,发现miR-10a-5p mimics+E2F3-3′UTR-wt组的荧光素酶活性显著降低。上述试验结果证实miR-10a-5p可以通过预测的位点与E2F3基因靶向结合,且miR-10a-5p对E2F3基因表达具有显著抑制作用,为进一步研究miR-10a-5p对猪肌肉发育是否产生调节作用奠定了基础。
本试验分析了不同物种miR-10a-5p的成熟序列,发现其具有较高的保守性,利用Target Scane生物信息学网站预测到miR-10a-5p与E2F3基因可能存在结合位点,并成功构建了E2F3基因3′UTR的野生型和突变型双荧光素酶报告基因质粒,通过验证发现miR-10a-5p与E2F3基因之间存在靶向关系,为探索两者对猪肌肉生长发育的作用提供了理论基础。
【参考文献】：
期刊论文
[1]干扰E2F7对C2C12成肌细胞增殖的影响[J]. 范源,甘麦邻,罗嘉,谭娅,张顺华,朱砺. 云南农业大学学报(自然科学). 2019(03)
[2]miR-363靶向调控E2F3表达影响HepG2细胞增殖和凋亡研究[J]. 姜哲,舒敏,王媛媛,朴莲淑. 实用肝脏病杂志. 2018(06)
[3]MicroRNA-152在胃癌细胞中表达及对细胞增殖的影响[J]. 王春明,左君波,居峰,姚立新. 海南医学. 2013(07)
博士论文
[1]猪不同年龄段肌肉组织microRNAs鉴定和差异表达分析[D]. 周朝伟.四川农业大学 2014
硕士论文
[1]MicroRNA-10a-5p在大鼠心衰发展中的作用和机制研究[D]. 尚佳.宁夏医科大学 2017
[2]miR-125a-5p在C2C12细胞增殖分化中的作用及机制研究[D]. 宋成创.西北农林科技大学 2015
[3]E2F3基因沉默对前列腺癌PC3细胞系细胞周期和细胞凋亡的影响[D]. 王密.天津医科大学 2011
本文编号：3489048
【文章来源】：黑龙江畜牧兽医. 2020,(15)北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
E2F3-3′UTR-mut PCR 鉴定结果
E2Fs基因家族编码的蛋白质可作为促进细胞周期S期进程的一种激活剂,当大多数细胞处于S期和G2期时,E2F3a等活化剂均以蛋白酶体和糖基化依赖性方式降解[13]。E2F3基因作为E2Fs基因家族中的一员,参与多种细胞的增殖、分化[14]、周期和凋亡等过程。如miR-363可以靶向调控E2F3基因,对HepG2细胞的增殖产生抑制作用,并促进其凋亡[15];E2F3基因还能够被miR-152显著下调,抑制肿瘤细胞的增殖[16];并且E2F3基因沉默能促进前列腺癌细胞系的凋亡[17];通过干扰E2F7基因的表达可以极显著促进E2F3的表达(P<0.01),同时极显著促进与成肌细胞增殖相关microRNAs的表达[18]。上述研究结果均表明,E2F3基因对多种细胞的增殖能够起到一定调节作用,但目前关于猪成肌细胞中对E2F3基因作用机制方面的研究报道少见。本试验首先通过生物信息miRNA Base数据库发现miR-10a-5p在多物种之间具有较高的保守性,并预测到E2F3基因存在与miR-10a-5p结合的3′UTR结合位点,推测可能是其靶基因。进一步构建E2F3基因的野生型双荧光素酶报告基因质粒,并通过对预测的结合位点进行定点突变构建突变型双荧光素酶报告基因质粒。将构建的质粒分别与miR-10a-5p mimics和mimics NC共转染至293T细胞中检测荧光素酶活性,发现miR-10a-5p mimics+E2F3-3′UTR-wt组的荧光素酶活性显著降低。上述试验结果证实miR-10a-5p可以通过预测的位点与E2F3基因靶向结合,且miR-10a-5p对E2F3基因表达具有显著抑制作用,为进一步研究miR-10a-5p对猪肌肉发育是否产生调节作用奠定了基础。
本试验分析了不同物种miR-10a-5p的成熟序列,发现其具有较高的保守性,利用Target Scane生物信息学网站预测到miR-10a-5p与E2F3基因可能存在结合位点,并成功构建了E2F3基因3′UTR的野生型和突变型双荧光素酶报告基因质粒,通过验证发现miR-10a-5p与E2F3基因之间存在靶向关系,为探索两者对猪肌肉生长发育的作用提供了理论基础。
【参考文献】：
期刊论文
[1]干扰E2F7对C2C12成肌细胞增殖的影响[J]. 范源,甘麦邻,罗嘉,谭娅,张顺华,朱砺. 云南农业大学学报(自然科学). 2019(03)
[2]miR-363靶向调控E2F3表达影响HepG2细胞增殖和凋亡研究[J]. 姜哲,舒敏,王媛媛,朴莲淑. 实用肝脏病杂志. 2018(06)
[3]MicroRNA-152在胃癌细胞中表达及对细胞增殖的影响[J]. 王春明,左君波,居峰,姚立新. 海南医学. 2013(07)
博士论文
[1]猪不同年龄段肌肉组织microRNAs鉴定和差异表达分析[D]. 周朝伟.四川农业大学 2014
硕士论文
[1]MicroRNA-10a-5p在大鼠心衰发展中的作用和机制研究[D]. 尚佳.宁夏医科大学 2017
[2]miR-125a-5p在C2C12细胞增殖分化中的作用及机制研究[D]. 宋成创.西北农林科技大学 2015
[3]E2F3基因沉默对前列腺癌PC3细胞系细胞周期和细胞凋亡的影响[D]. 王密.天津医科大学 2011
本文编号：3489048
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