猪流行性腹泻病毒AJ1102株的分离、鉴定及其分子进化特征
发布时间：2021-11-11 18:59
猪流行性腹泻（porcine epidemicdiarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种以腹泻、呕吐和脱水为主要特征的猪肠道传染病。该病1971年首次在英国被发现,随后,其它欧洲国家和部分亚洲国家相继报道了该病的发生与流行。以前,美国从未出现PEDV,但从2013年5月以来,美国多个州发生PEDV的流行,引起了美国乃至全球养猪业的高度重视。我国是上世纪80年代初首次发生PEDV。由于该病对新生仔猪的感染率和致死率均很高,给养猪业造成了巨大的经济损失。2010年冬季以来,流行性腹泻在我国10多个省市暴发并呈现新的流行特征：发病率和致死率高、流行广、损失大,而且以前接种过猪流行性腹泻疫苗的猪也未能幸免,提示该流行毒株毒力较强,而且可能与现有疫苗毒株存在较大的差异,导致现有疫苗难以提供免疫保护。有意义的是,美国2013年流行的PEDV在基因组水平上与我国流行的PEDV同源性高达99.5%,称为中国变异株。针对当前流行的猪流行性腹泻病毒,本研究开展了检测方法的建立、病毒的分离与鉴定,同时,对流行毒株的遗传进化特征进行了深入研究。主要研究内容如下：1. PEDV RT...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：108 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第1章 文献综述
1.1 猪流行性腹泻
1.2 PEDV的流行病学特点
1.2.1 宿主因素
1.2.2 病毒因素
1.2.3 疫苗因素
1.2.4 饲养管理与环境因素
1.3 PEDV的流行病学
1.4 PEDV的分子结构和遗传特征
1.4.0 PEDV的分子结构
1.4.1 5’UTR
1.4.2 ORF1
1.4.3 S蛋白
1.4.4 ORF3
1.4.5 M蛋白
1.4.6 E蛋白
1.4.7 N蛋白
1.4.8 3’UTR
1.4.9 PEDV的分子流行病学研究进展
1.5 PEDV的检测方法
1.6 PEDV疫苗的研究
1.6.1 灭活疫苗
1.6.2 弱毒疫苗
1.6.3 基因工程疫苗
1.6.4 核酸疫苗
1.6.5 转基因植物疫苗
1.7 PEDV的临床治疗
1.8 姜黄素与抗病毒
第2章 研究目的与意义
第3章 材料与方法
3.1 试验材料
3.1.1 病料及实验动物
3.1.2 细胞与菌株
3.1.3 载体与质粒
3.1.4 工具酶及主要试剂
3.1.5 培养基与抗生素及其配制
3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制
3.1.7 分子生物学分析软件
3.2 试验方法
3.2.1 病料采集与处理
3.2.2 病毒的分离
3.2.3 PEDV的增殖
3.2.4 限制性内切酶酶切反应
3.2.5 PCR产物或酶切产物的电泳检测
3.2.6 PCR产物或酶切产物回收与纯化
3.2.7 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
3.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
3.2.9 连接产物的转化
3.2.10 质粒的制备与鉴定
3.2.11 病毒粒子的电镜观察
3.2.12 病毒滴度的测定
3.2.13 样品总RNA的提取及cDNA的合成
3.2.14 统计学方法
第4章 结果与分析
4.1 猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及流行病学调查
4.1.1 猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立
4.1.2 猪流行性腹泻病毒流行病学调查
4.2 猪流行性腹泻病毒的分离与鉴定
4.2.1 病毒的分离
4.2.2 PEDV AJ1102株病毒毒价的测定
4.2.3 PEDV AJ1102株病毒形态的电镜观察结果
4.2.4 间接免疫荧光实验(IFA)
4.2.5 病毒的RT-PCR检测
4.3 PEDV AJ1102株的全基因组序列的测定与进化分析
4.3.1 PEDV AJ1102株基因片段的RT-PCR扩增
4.3.2 PEDV AJ1102株各扩增片段的测序及序列拼接
4.3.3 PEDV AJ1102株全基因组序列的遗传进化分析
4.3.4 PEDV AJ1102株5’UTR的结构分析
4.3.6 PEDV AJ1102株3’UTR的结构分析
4.3.7 PEDV AJ1102株S蛋白的遗传进化分析
4.3.8 PEDV AJ1102株M蛋白的遗传进化分析
4.3.9 PEDV AJ1102株N蛋白的遗传进化分析
4.3.10 PEDV AJ1102株ORF3的遗传进化分析
4.3.11 PEDV AJ1102株E蛋白的遗传进化分析
4.3.12 PEDV AJ1102株全基因组的同源重组分析
4.4 PEDV流行毒株的遗传标志分析
4.5 中药姜黄素抗PEDV增殖的分析
4.5.1 姜黄素对Vero细胞的毒性试验
4.5.2 姜黄素抗PEDV增殖的分析
第5章 讨论与结论
5.1 讨论
5.1.1 PEDV RT-PCR检测方法的建立
5.1.2 PEDV的流行病学调查及AJ1102株的分离鉴定
5.1.3 PEDV AJ102株全基因组序列和S、M、N、ORF3基因序列分析
5.1.4 PEDV AJ1102株的致病性分析
5.1.5 PEDV的毒力相关基因
5.1.6 中药姜黄素抗PEDV增殖的分析
5.2 结论
参考文献
致谢
附录
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析[J]. 吕茂杰,陈建飞,时洪艳,陈小金,范秀萍,申识川,冯力. 微生物学报. 2011(05)
[2]猪流行性腹泻病毒S蛋白受体结合域的分析[J]. 孙东波,陈建飞,时洪艳,申识川,吕茂杰,范秀萍,陈洪岩,冯力. 畜牧兽医学报. 2009(04)
[3]猪流行性腹泻病毒纤突蛋白基因克隆与序列分析[J]. 李建强,柳纪省,兰喜,程杰,杨敏,吴润,殷相平,李宝玉,李学瑞,杨彬. 农业生物技术学报. 2007(04)
[4]猪流行性腹泻病毒的分离培养与鉴定[J]. 钱永清,闻人楚,唐永兰,孙智锋. 上海农业学报. 1999(02)
[5]猪流行性腹泻弱毒株的培育[J]. 佟有恩,冯力,李伟杰,王明,马思奇. 中国畜禽传染病. 1998(06)
[6]猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻二联氢氧化铝细胞灭活疫苗的研究[J]. 马思奇,王明,冯力,李伟杰. 中国畜禽传染病. 1995(06)
[7]猪流行性腹泻病毒适应Vero细胞培养及以传代细胞毒制备氢氧化铝灭活疫苗免疫效力试验[J]. 马思奇,王明,周金法,冯力. 中国畜禽传染病. 1994(02)
[8]猪流行性腹泻灭活疫苗的研究[J]. 王明,马思奇,周金法,于文涛,魏风祥,崔现兰,冯力,佟有恩,黄绍棠,刘长明. 中国畜禽传染病. 1993(05)
[9]猪流行性腹泻病毒实验感染猪排毒规律的研究[J]. 王新平,朱维正. 兽医大学学报. 1988(01)
[10]应用猪胎肠单层细胞培养猪流行性腹泻病毒的研究[J]. 宣华,邢德坤,王殿瀛,朱维正,赵凤玉,巩怀俊,费思阁. 兽医大学学报. 1984(03)
博士论文
[1]猪流行性腹泻病毒全基因组序列分析及感染性cDNA克隆的构建[D]. 陈建飞.中国农业科学院 2012
硕士论文
[1]猪传染性胃肠炎和流行性腹泻二联核酸疫苗免疫效力研究[D]. 孟凡丹.东北农业大学 2011
本文编号：3489353
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：108 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第1章 文献综述
1.1 猪流行性腹泻
1.2 PEDV的流行病学特点
1.2.1 宿主因素
1.2.2 病毒因素
1.2.3 疫苗因素
1.2.4 饲养管理与环境因素
1.3 PEDV的流行病学
1.4 PEDV的分子结构和遗传特征
1.4.0 PEDV的分子结构
1.4.1 5’UTR
1.4.2 ORF1
1.4.3 S蛋白
1.4.4 ORF3
1.4.5 M蛋白
1.4.6 E蛋白
1.4.7 N蛋白
1.4.8 3’UTR
1.4.9 PEDV的分子流行病学研究进展
1.5 PEDV的检测方法
1.6 PEDV疫苗的研究
1.6.1 灭活疫苗
1.6.2 弱毒疫苗
1.6.3 基因工程疫苗
1.6.4 核酸疫苗
1.6.5 转基因植物疫苗
1.7 PEDV的临床治疗
1.8 姜黄素与抗病毒
第2章 研究目的与意义
第3章 材料与方法
3.1 试验材料
3.1.1 病料及实验动物
3.1.2 细胞与菌株
3.1.3 载体与质粒
3.1.4 工具酶及主要试剂
3.1.5 培养基与抗生素及其配制
3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制
3.1.7 分子生物学分析软件
3.2 试验方法
3.2.1 病料采集与处理
3.2.2 病毒的分离
3.2.3 PEDV的增殖
3.2.4 限制性内切酶酶切反应
3.2.5 PCR产物或酶切产物的电泳检测
3.2.6 PCR产物或酶切产物回收与纯化
3.2.7 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
3.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
3.2.9 连接产物的转化
3.2.10 质粒的制备与鉴定
3.2.11 病毒粒子的电镜观察
3.2.12 病毒滴度的测定
3.2.13 样品总RNA的提取及cDNA的合成
3.2.14 统计学方法
第4章 结果与分析
4.1 猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及流行病学调查
4.1.1 猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立
4.1.2 猪流行性腹泻病毒流行病学调查
4.2 猪流行性腹泻病毒的分离与鉴定
4.2.1 病毒的分离
4.2.2 PEDV AJ1102株病毒毒价的测定
4.2.3 PEDV AJ1102株病毒形态的电镜观察结果
4.2.4 间接免疫荧光实验(IFA)
4.2.5 病毒的RT-PCR检测
4.3 PEDV AJ1102株的全基因组序列的测定与进化分析
4.3.1 PEDV AJ1102株基因片段的RT-PCR扩增
4.3.2 PEDV AJ1102株各扩增片段的测序及序列拼接
4.3.3 PEDV AJ1102株全基因组序列的遗传进化分析
4.3.4 PEDV AJ1102株5’UTR的结构分析
4.3.6 PEDV AJ1102株3’UTR的结构分析
4.3.7 PEDV AJ1102株S蛋白的遗传进化分析
4.3.8 PEDV AJ1102株M蛋白的遗传进化分析
4.3.9 PEDV AJ1102株N蛋白的遗传进化分析
4.3.10 PEDV AJ1102株ORF3的遗传进化分析
4.3.11 PEDV AJ1102株E蛋白的遗传进化分析
4.3.12 PEDV AJ1102株全基因组的同源重组分析
4.4 PEDV流行毒株的遗传标志分析
4.5 中药姜黄素抗PEDV增殖的分析
4.5.1 姜黄素对Vero细胞的毒性试验
4.5.2 姜黄素抗PEDV增殖的分析
第5章 讨论与结论
5.1 讨论
5.1.1 PEDV RT-PCR检测方法的建立
5.1.2 PEDV的流行病学调查及AJ1102株的分离鉴定
5.1.3 PEDV AJ102株全基因组序列和S、M、N、ORF3基因序列分析
5.1.4 PEDV AJ1102株的致病性分析
5.1.5 PEDV的毒力相关基因
5.1.6 中药姜黄素抗PEDV增殖的分析
5.2 结论
参考文献
致谢
附录
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析[J]. 吕茂杰,陈建飞,时洪艳,陈小金,范秀萍,申识川,冯力. 微生物学报. 2011(05)
[2]猪流行性腹泻病毒S蛋白受体结合域的分析[J]. 孙东波,陈建飞,时洪艳,申识川,吕茂杰,范秀萍,陈洪岩,冯力. 畜牧兽医学报. 2009(04)
[3]猪流行性腹泻病毒纤突蛋白基因克隆与序列分析[J]. 李建强,柳纪省,兰喜,程杰,杨敏,吴润,殷相平,李宝玉,李学瑞,杨彬. 农业生物技术学报. 2007(04)
[4]猪流行性腹泻病毒的分离培养与鉴定[J]. 钱永清,闻人楚,唐永兰,孙智锋. 上海农业学报. 1999(02)
[5]猪流行性腹泻弱毒株的培育[J]. 佟有恩,冯力,李伟杰,王明,马思奇. 中国畜禽传染病. 1998(06)
[6]猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻二联氢氧化铝细胞灭活疫苗的研究[J]. 马思奇,王明,冯力,李伟杰. 中国畜禽传染病. 1995(06)
[7]猪流行性腹泻病毒适应Vero细胞培养及以传代细胞毒制备氢氧化铝灭活疫苗免疫效力试验[J]. 马思奇,王明,周金法,冯力. 中国畜禽传染病. 1994(02)
[8]猪流行性腹泻灭活疫苗的研究[J]. 王明,马思奇,周金法,于文涛,魏风祥,崔现兰,冯力,佟有恩,黄绍棠,刘长明. 中国畜禽传染病. 1993(05)
[9]猪流行性腹泻病毒实验感染猪排毒规律的研究[J]. 王新平,朱维正. 兽医大学学报. 1988(01)
[10]应用猪胎肠单层细胞培养猪流行性腹泻病毒的研究[J]. 宣华,邢德坤,王殿瀛,朱维正,赵凤玉,巩怀俊,费思阁. 兽医大学学报. 1984(03)
博士论文
[1]猪流行性腹泻病毒全基因组序列分析及感染性cDNA克隆的构建[D]. 陈建飞.中国农业科学院 2012
硕士论文
[1]猪传染性胃肠炎和流行性腹泻二联核酸疫苗免疫效力研究[D]. 孟凡丹.东北农业大学 2011
本文编号：3489353
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3489353.html
