基于反向遗传技术的猪瘟病毒标记C株的构建及其免疫原性评价
发布时间：2021-11-12 14:47
猪瘟（classical swine fever,CSF）是一种以高热稽留和广泛性出血为主要特征的猪的高度传染性疾病,对我国乃至全球多个国家的养猪业造成巨大的经济损失。目前,我国主要采取免疫接种猪瘟兔化弱毒疫苗株（C株或HCLV株）的措施来预防猪瘟。C株是一株集良好的安全性和免疫原性于一身的弱毒疫苗株,在全球猪瘟的防控中发挥了重要作用。但是,现阶段还没有商品化的标记C株疫苗可用,这使得在临床上区分野毒感染与疫苗接种（differentiation between infected and vaccinated animals,DIVA）还存在一定的技术障碍。因此,我们需要将C株开发为标记疫苗株,使其具备标记的特性,在猪瘟净化工作上继续发挥优势。本实验室前期研究发现,单克隆抗体（monoclonal antibody,MAb）HQ06是CSFV E2蛋白的特异性抗体,并鉴定其识别的抗原表位为116LFDGTNP122,且117F、119G和122P是该表位的3个关键氨基酸。本研究...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CSFV基因组结构示意图（MURRAYetal.,2008）
为丙氨酸（A）的C株感染性克隆pHCLV-E2G119A以及CSFVE2蛋白LFDGTNP抗原表位第122位脯氨酸（122P）突变为丙氨酸（A）的C株感染性克隆pHCLV-E2G119A。之后，利用核酸限制性内切酶和二代测序对获得的3个感染性克隆进行鉴定和基因测序。同时，将上述测序正确的质粒转化到商品化的大肠杆菌感受态细胞DH10B中，通过挑取阳性的单克隆，对转化成功的大肠杆菌进行大量扩增。最终取300mL的菌液按照无内毒素大提质粒试剂盒的操作说明说进行质粒提取工作，提取的质粒经测序鉴定验证无误后，保存-20℃用于后续试验。图2-1感染性克隆pHCLV-E2F117A、pHCLV-E2G119A和pHCLV-E2P122A的构建示意图Fig.2-1SchematicrepresentationofpHCLV-E2F117A,pHCLV-E2G119AandpHCLV-E2P122A.
中国农业科学院硕士学位论文第二章基于反向遗传技术的猪瘟病毒标记C株的构建及其免疫原性评价192.2结果2.2.1感染性克隆的酶切鉴定用限制性核酸内切酶HindIII对构建的3个感染性克隆pHCLV-E2F117A、pHCLV-E2G119A和pHCLV-E2P122A进行鉴定。琼脂糖凝胶电泳显示，用HindIII对构建的3个感染性克隆进行酶切后，得到的基因片段与预期大小一致（图2-2）。同时，利用针对CSFVE2基因的特异性引物对构建的3个感染性克隆的相应区域进行PCR扩增，之后送测序。测序结果表明，3个感染性克隆的基因序列与预期一致。这说明嵌合病毒的感染性克隆构建成功。图2-2感染性克隆pHCLV-E2F117A、pHCLV-E2G119A和pHCLV-E2P122A的酶切分析图Fig.2-2RestrictionenzymeanalysisofpHCLV-E2F117A,pHCLV-E2G119AandpHCLV-E2P122A2.2.2突变体病毒的拯救我们将获得的3个感染性克隆pHCLV-E2F117A、pHCLV-E2G119A和pHCLV-E2P122A分别转染SK6细胞，连续传代拯救3株突变体病毒，用CSFV抗原检测试剂盒（IDEXX）对第5代和第7代的SK6细胞上清进行检测，结果显示，所拯救的第7代病毒的Erns蛋白抗原为阳性（图2-3）。按照病毒RNA提取说明书提取拯救的病毒基因组RNA，之后通过RT-PCR扩增目的基因并进行测序。结果表明，3株突变体病毒基因组的目的基因与预期的大小一致，测序结果显示突变体病毒的目的基因不存在其它突变。以上结果表明，我们获得了CSFVE2蛋白的LFDGTNP抗原表位3个关键氨基酸突变的突变体病毒。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于哺乳动物细胞表达系统的猪瘟基因工程E2亚单位疫苗动物免疫效果评价[J]. 颜仁和,刘蕾,王升尧,李安迪,万鹏飞,仇珍珍,范根成,李红卫,杜元钊,高永新. 中国兽医学报. 2020(01)
[2]猪瘟兔化弱毒疫苗（C株）——10年回眸[J]. 韩玉莹,李永锋,谢利豹,仇华吉. 中国预防兽医学报. 2019(06)
[3]猪瘟标记疫苗研究进展[J]. 易琳,黎鑫,陈金顶,邹创智,范双旗,马圣明,张媛媛,赵明秋. 中国猪业. 2018(11)
[4]新型猪瘟疫苗的研究进展[J]. 任鹏举,李鹏,张秋雨,王亚平,武乐祎,王选年. 中国畜牧兽医. 2018(07)
[5]表达猪瘟E2基因的重组伪狂犬病毒构建及其生物学特性分析[J]. 韩爽,陈晓春,邓永,吴华伟,曹明慧,李俊平,夏业才. 中国兽药杂志. 2018(05)
[6]表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株的构建与鉴定[J]. 张玲楷,李永锋,谢利豹,孙元,王晓,仇华吉. 生物工程学报. 2018(02)
[7]中国兽医药品监察所OIE猪瘟参考实验室猪瘟研究进展[J]. 王琴,赵启祖,徐璐,张乾义,邹兴启,朱元源,宁宜宝,李翠,范学政. 猪业科学. 2017(11)
[8]猪瘟DIVA疫苗研究现状[J]. 赵启祖. 兽医导刊. 2017(21)
[9]新型猪瘟疫苗研究进展[J]. 王春花,孙元,仇华吉. 生物工程学报. 2013(07)
[10]纳米磷酸钙作为猪瘟多肽疫苗佐剂的研究[J]. 郭沛,王霄旸,薛飞群,江善祥,陆泳良,王昊欣. 中国动物传染病学报. 2012(06)
博士论文
[1]猪瘟病毒强弱毒感染猪PBMCs转录组分析及HES4抗病毒分子机制研究[D]. 王竞晗.中国农业科学院 2018
[2]靶向猪瘟病毒E2蛋白亲和肽的理性设计及其应用[D]. 余秋颖.四川农业大学 2018
[3]猪瘟病毒C株重组标记疫苗候选株免疫原性与鉴别检测[D]. 廖迅.浙江大学 2016
[4]猪瘟病毒重组腺病毒载体疫苗的构建及免疫保护试验[D]. 李河林.西北农林科技大学 2015
硕士论文
[1]猪瘟病毒E2蛋白酵母表达及其免疫活性的初步研究[D]. 周稳.西北农林科技大学 2019
[2]猪瘟疫苗C株WH303表位突变毒株的构建及在细胞和兔体中特性研究[D]. 刘元杰.中国兽医药品监察所 2018
[3]猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒遗传稳定性和免疫剂量研究[D]. 张浩.西北农林科技大学 2008
本文编号：3491128
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CSFV基因组结构示意图（MURRAYetal.,2008）
为丙氨酸（A）的C株感染性克隆pHCLV-E2G119A以及CSFVE2蛋白LFDGTNP抗原表位第122位脯氨酸（122P）突变为丙氨酸（A）的C株感染性克隆pHCLV-E2G119A。之后，利用核酸限制性内切酶和二代测序对获得的3个感染性克隆进行鉴定和基因测序。同时，将上述测序正确的质粒转化到商品化的大肠杆菌感受态细胞DH10B中，通过挑取阳性的单克隆，对转化成功的大肠杆菌进行大量扩增。最终取300mL的菌液按照无内毒素大提质粒试剂盒的操作说明说进行质粒提取工作，提取的质粒经测序鉴定验证无误后，保存-20℃用于后续试验。图2-1感染性克隆pHCLV-E2F117A、pHCLV-E2G119A和pHCLV-E2P122A的构建示意图Fig.2-1SchematicrepresentationofpHCLV-E2F117A,pHCLV-E2G119AandpHCLV-E2P122A.
中国农业科学院硕士学位论文第二章基于反向遗传技术的猪瘟病毒标记C株的构建及其免疫原性评价192.2结果2.2.1感染性克隆的酶切鉴定用限制性核酸内切酶HindIII对构建的3个感染性克隆pHCLV-E2F117A、pHCLV-E2G119A和pHCLV-E2P122A进行鉴定。琼脂糖凝胶电泳显示，用HindIII对构建的3个感染性克隆进行酶切后，得到的基因片段与预期大小一致（图2-2）。同时，利用针对CSFVE2基因的特异性引物对构建的3个感染性克隆的相应区域进行PCR扩增，之后送测序。测序结果表明，3个感染性克隆的基因序列与预期一致。这说明嵌合病毒的感染性克隆构建成功。图2-2感染性克隆pHCLV-E2F117A、pHCLV-E2G119A和pHCLV-E2P122A的酶切分析图Fig.2-2RestrictionenzymeanalysisofpHCLV-E2F117A,pHCLV-E2G119AandpHCLV-E2P122A2.2.2突变体病毒的拯救我们将获得的3个感染性克隆pHCLV-E2F117A、pHCLV-E2G119A和pHCLV-E2P122A分别转染SK6细胞，连续传代拯救3株突变体病毒，用CSFV抗原检测试剂盒（IDEXX）对第5代和第7代的SK6细胞上清进行检测，结果显示，所拯救的第7代病毒的Erns蛋白抗原为阳性（图2-3）。按照病毒RNA提取说明书提取拯救的病毒基因组RNA，之后通过RT-PCR扩增目的基因并进行测序。结果表明，3株突变体病毒基因组的目的基因与预期的大小一致，测序结果显示突变体病毒的目的基因不存在其它突变。以上结果表明，我们获得了CSFVE2蛋白的LFDGTNP抗原表位3个关键氨基酸突变的突变体病毒。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于哺乳动物细胞表达系统的猪瘟基因工程E2亚单位疫苗动物免疫效果评价[J]. 颜仁和,刘蕾,王升尧,李安迪,万鹏飞,仇珍珍,范根成,李红卫,杜元钊,高永新. 中国兽医学报. 2020(01)
[2]猪瘟兔化弱毒疫苗（C株）——10年回眸[J]. 韩玉莹,李永锋,谢利豹,仇华吉. 中国预防兽医学报. 2019(06)
[3]猪瘟标记疫苗研究进展[J]. 易琳,黎鑫,陈金顶,邹创智,范双旗,马圣明,张媛媛,赵明秋. 中国猪业. 2018(11)
[4]新型猪瘟疫苗的研究进展[J]. 任鹏举,李鹏,张秋雨,王亚平,武乐祎,王选年. 中国畜牧兽医. 2018(07)
[5]表达猪瘟E2基因的重组伪狂犬病毒构建及其生物学特性分析[J]. 韩爽,陈晓春,邓永,吴华伟,曹明慧,李俊平,夏业才. 中国兽药杂志. 2018(05)
[6]表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株的构建与鉴定[J]. 张玲楷,李永锋,谢利豹,孙元,王晓,仇华吉. 生物工程学报. 2018(02)
[7]中国兽医药品监察所OIE猪瘟参考实验室猪瘟研究进展[J]. 王琴,赵启祖,徐璐,张乾义,邹兴启,朱元源,宁宜宝,李翠,范学政. 猪业科学. 2017(11)
[8]猪瘟DIVA疫苗研究现状[J]. 赵启祖. 兽医导刊. 2017(21)
[9]新型猪瘟疫苗研究进展[J]. 王春花,孙元,仇华吉. 生物工程学报. 2013(07)
[10]纳米磷酸钙作为猪瘟多肽疫苗佐剂的研究[J]. 郭沛,王霄旸,薛飞群,江善祥,陆泳良,王昊欣. 中国动物传染病学报. 2012(06)
博士论文
[1]猪瘟病毒强弱毒感染猪PBMCs转录组分析及HES4抗病毒分子机制研究[D]. 王竞晗.中国农业科学院 2018
[2]靶向猪瘟病毒E2蛋白亲和肽的理性设计及其应用[D]. 余秋颖.四川农业大学 2018
[3]猪瘟病毒C株重组标记疫苗候选株免疫原性与鉴别检测[D]. 廖迅.浙江大学 2016
[4]猪瘟病毒重组腺病毒载体疫苗的构建及免疫保护试验[D]. 李河林.西北农林科技大学 2015
硕士论文
[1]猪瘟病毒E2蛋白酵母表达及其免疫活性的初步研究[D]. 周稳.西北农林科技大学 2019
[2]猪瘟疫苗C株WH303表位突变毒株的构建及在细胞和兔体中特性研究[D]. 刘元杰.中国兽医药品监察所 2018
[3]猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒遗传稳定性和免疫剂量研究[D]. 张浩.西北农林科技大学 2008
本文编号：3491128
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