基于E2蛋白的猪瘟病毒IFA检测方法建立及亚单位疫苗的初步研制
发布时间：2021-11-15 23:08
猪瘟是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus,CSFV）引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,在我国仍时有发生,给养猪业造成重大损失。C株是世界上应用最为广泛的减毒疫苗株。大量数据表明,C株疫苗免疫效力好、安全性高,对小猪、怀孕母猪甚至是处于免疫抑制的猪群均不造成病理损伤,但是这种类型的减毒活疫苗刺激机体产生的抗体,很难和野毒感染猪产生的抗体区分开,这不利于控制猪瘟的流行与净化。为了能区分疫苗免疫动物和感染动物,DIVA疫苗是目前的研究热点。E2囊膜糖蛋白是猪瘟病毒的主要结构蛋白,是猪瘟病毒毒力及宿主范围的主要决定性因素,位于病毒粒子外表面,有跨膜区,是建立猪瘟病毒血清学检测方法的主要抗原。因此,猪瘟病毒E2蛋白是开发猪瘟病毒新型疫苗及诊断试剂的重要蛋白分子。本研究利用原核表达系统表达了猪瘟病毒的E2蛋白,利用纯化的E2蛋白制备了猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体,进一步利用制备的单克隆抗体建立了猪瘟病毒的间接免疫荧光检测方法;另外,利用纯化的E2蛋白初步研制了猪瘟E2蛋白亚单位疫苗,免疫攻毒试验结果表明,研制的亚单位疫苗免疫效果良好,为猪瘟标记亚单位疫苗的开发奠...
【文章来源】：扬州大学江苏省
【文章页数】：93 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
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【参考文献】：
期刊论文
[1]猪瘟兔化弱毒间接免疫荧光鉴定方法的建立[J]. 牛成明,姚静,杨灵芝,杨琴,马景霞,朱杰. 中国动物检疫. 2016(10)
[2]猪瘟疫苗质量的替代检验方法研究进展[J]. 祖立闯,谢金文,沈志强,李娇,唐娜,王金良,苗立中,张娜,王艳,吴信明. 动物医学进展. 2015(02)
[3]猪瘟病毒间接免疫荧光检测方法的建立[J]. 宁蓬勃,任敏,梁武龙,何雷,郭抗抗,张彦明. 黑龙江畜牧兽医. 2013(15)
[4]荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系[J]. 葛叶,张兴娟,朱庆虎,韩秋影,王牟平,李伟杰,孙建宏,仇华吉. 中国预防兽医学报. 2011(09)
[5]SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟疫苗病毒含量[J]. 李安,崔言顺,沈志强,谢金文,王金良,李建亮,曲光刚,李峰. 中国兽医学报. 2010(08)
[6]用RT-PCR方法检测猪瘟细胞苗中污染牛病毒性腹泻病毒[J]. 范学政,宁宜宝,王琴,徐璐,沈青春. 中国兽医杂志. 2010(01)
[7]猪瘟兔化弱毒疫苗——半个世纪的回顾[J]. 仇华吉,童光志,沈荣显. 中国农业科学. 2005(08)
[8]猪瘟病毒基因组非编码区的定性、定量与结构分析[J]. 肖明,张楚瑜,祝志展,吴海祥. 科学通报. 2001(07)
[9]猪瘟单抗诊断试剂的生产与推广应用[J]. 王在时,丘惠深,廖国安. 中国兽药杂志. 1995(04)
硕士论文
[1]稳定分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步应用[D]. 许保疆.河南农业大学 2009
[2]特异性识别猪瘟病毒野毒株的单克隆抗体的制备[D]. 夏照和.中国农业科学院 2008
[3]猪瘟病毒部分基因的克隆及其原核表达重组质粒的构建[D]. 谢金文.安徽农业大学 2006
[4]猪瘟病毒E2基因的表达及其间接ELISA诊断方法的研究[D]. 胡慧.西北农林科技大学 2004
本文编号：3497683
【文章来源】：扬州大学江苏省
【文章页数】：93 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１．４．ｐＭＤ１８Ｔ－ＥＴ质粒双酶切（１？４：?ｐＭＤ１８Ｔ－Ｅ：２质粒；５？６：?ｐＭＤ１８Ｔ－Ｅ２质粒双酶切）??
?＾??在３８?ｋＤ处（包括标签蛋白），出现预期大小的目的蛋白，而且当ＩＰＴＧ诱导表达４?ｈ时，??目的蛋白表达量最多（图１．９）。??Ｍ?１?２?３?４??，５０ｋＤ??麵．禱?．??７０ｋＤ??２０Ｈ）?－?％ｈ＇?＾?ｉ??—■ｍｕ??图１．９．ＩＰＴＧ诱导表达时间的确定（１？４：０ｈ，?２ｈ，４ｈ，?５ｈ）??Ｆｉｇ?１．９．?Ｔｈｅ?ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｉｎｄｕｃｉｎｇ?ｔｉｍｅ?ｏｆ?ＩＰＴＧ?ｆｏｒ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?（１－４：?Ｏｈ，?２ｈ，?４ｈ，?５ｈ）??因此，最终确定重组表达菌ｐＥＴ２８ａ－ＣＳＦＶ－Ｅ２的最佳诱导表达条件为：ＩＰＴＧ浓度为??０．２ｍｍｏｌ／Ｌ，诱导时间为４ｈ。??３．７纯化Ｅ２蛋白的ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ检测??以０．２?ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，对４００?ｍｌ重组菌ｐＥＴ２８ａ－ＣＳＦＶ－Ｅ２进行大量诱导表达，加入??ＩＰＴＧ?４?ｈ后停止诱导，将诱导菌液１２０００?ｒｐｍ离心３０?ｍｉｎ收集菌体沉淀，着体超声波处理??后
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【参考文献】：
期刊论文
[1]猪瘟兔化弱毒间接免疫荧光鉴定方法的建立[J]. 牛成明,姚静,杨灵芝,杨琴,马景霞,朱杰. 中国动物检疫. 2016(10)
[2]猪瘟疫苗质量的替代检验方法研究进展[J]. 祖立闯,谢金文,沈志强,李娇,唐娜,王金良,苗立中,张娜,王艳,吴信明. 动物医学进展. 2015(02)
[3]猪瘟病毒间接免疫荧光检测方法的建立[J]. 宁蓬勃,任敏,梁武龙,何雷,郭抗抗,张彦明. 黑龙江畜牧兽医. 2013(15)
[4]荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系[J]. 葛叶,张兴娟,朱庆虎,韩秋影,王牟平,李伟杰,孙建宏,仇华吉. 中国预防兽医学报. 2011(09)
[5]SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟疫苗病毒含量[J]. 李安,崔言顺,沈志强,谢金文,王金良,李建亮,曲光刚,李峰. 中国兽医学报. 2010(08)
[6]用RT-PCR方法检测猪瘟细胞苗中污染牛病毒性腹泻病毒[J]. 范学政,宁宜宝,王琴,徐璐,沈青春. 中国兽医杂志. 2010(01)
[7]猪瘟兔化弱毒疫苗——半个世纪的回顾[J]. 仇华吉,童光志,沈荣显. 中国农业科学. 2005(08)
[8]猪瘟病毒基因组非编码区的定性、定量与结构分析[J]. 肖明,张楚瑜,祝志展,吴海祥. 科学通报. 2001(07)
[9]猪瘟单抗诊断试剂的生产与推广应用[J]. 王在时,丘惠深,廖国安. 中国兽药杂志. 1995(04)
硕士论文
[1]稳定分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步应用[D]. 许保疆.河南农业大学 2009
[2]特异性识别猪瘟病毒野毒株的单克隆抗体的制备[D]. 夏照和.中国农业科学院 2008
[3]猪瘟病毒部分基因的克隆及其原核表达重组质粒的构建[D]. 谢金文.安徽农业大学 2006
[4]猪瘟病毒E2基因的表达及其间接ELISA诊断方法的研究[D]. 胡慧.西北农林科技大学 2004
本文编号：3497683
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