猪流行性腹泻病毒截短S1基因的原核表达及间接ELISA的建立

发布时间：2021-11-15 23:43

　　猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的猪的一种急性、高度传染性肠道疾病，以哺乳仔猪呕吐、严重腹泻和脱水死亡为主要特征。不同品种和不同年龄的猪对本病均易感，对哺乳仔猪的危害最为严重。1周龄以内的哺乳仔猪于开始腹泻后2–4d死亡，致死率高达90%以上，给养猪业造成了严重的经济损失。研究表明，S基因编码的S蛋白是PEDV的主要的结构蛋白之一，S蛋白可以诱导机体产生中和抗体。本试验根据GenBank公布的CV777S基因序列设计一对特异性引物，通过RT-PCR扩增出截短S1基因。将扩增出的片段克隆到PMD-18-T载体上，通过测序分析证实该片段与PEDV的S基因序列一致，然后将克隆化截短S1基因亚克隆到表达载体pET-32a（+），获得了重组表达质粒pET-S1。将重组表达质粒pET-S1转化宿主菌BL21（DE3），经IPTG诱导，表达了截短S1蛋白。通过优化诱导时间和IPTG的浓度，确定了诱导表达的最佳条件：诱导时间为4h，IPTG浓度为0.6mmo1/... 

【文章来源】：江西农业大学江西省

【文章页数】：59 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 猪流行性腹泻病毒（PEDV）研究进展
        1.1 PEDV 的分类地位及形态特征
            1.1.1 PEDV 的分类地位
            1.1.2 PEDV 的形态特征
        1.2 PEDV 的理化特征
        1.3 PEDV 的培养特性
        1.4 PEDV 的病原性
        1.5 PEDV 遗传分子生物学特性
            1.5.1 基因组结构
            1.5.2 非结构基因
            1.5.3 结构基因及其产物
    2 PEDV 诊断方法
        2.1 免疫电镜法
        2.2 免疫荧光法
        2.3 病毒中和法
        2.4 RT–PCR 法
        2.5 ELISA 法
    3 PEDV S 蛋白研究进展
    4 本试验的目的和意义
    5 研究内容与试验流程
        5.1 研究内容
        5.2 试验流程
第二章 猪流行性腹泻病毒截短 S1 基因的原核表达
    1 材料
        1.1 试验材料
        1.2 主要仪器设备
        1.3 试剂、培养基的配制
        1.4 琼脂糖凝胶电泳所用试剂的配制
        1.5 SDS-PAGE 试剂配制
        1.6 蛋白纯化试剂的配制
        1.7 蛋白透析复性液的配制
            1.7.1 透析袋处理液
            1.7.2 透析复性液
        1.8 Western Blot 试剂配制
    2 试验方法
        2.1 重组质粒 PMD-S1 的构建
            2.1.1 引物的设计
            2.1.2 病毒 RNA 的提取
            2.1.3 cDNA 的合成
            2.1.4 目的基因的 PCR 扩增
            2.1.5 目的基因的回收纯化
            2.1.6 目的基因的 T-A 克隆
            2.1.7 连接产物的转化
            2.1.8 重组菌的筛选和鉴定
        2.2 重组表达质粒 pET-S1 的构建
            2.2.1 带有粘性末端的目的基因及原核表达载体的制备
            2.2.2 表达载体与目的基因的连接
            2.2.3 连接产物的转化
            2.2.4 重组表达菌的筛选和鉴定
        2.3 目的基因的诱导表达
            2.3.1 表达条件的优化
            2.3.2 重组蛋白的大量表达
            2.3.3 重组蛋白表达形式的鉴定
        2.4 重组蛋白纯化、复性
            2.4.1 咪唑浓度优化及重组蛋白纯化
            2.4.2 重组蛋白透析复性
        2.5 SDS－PAGE 分析
        2.6 Western Blot 分析
    3 试验结果
        3.1 重组质粒 PMD-S1 的构建
            3.1.1 目的基因的 RT-PCR 扩增
            3.1.2 重组质粒 PMD-S1 的筛选和鉴定
        3.2 重组表达质粒 pET-S1 的构建
            3.2.1 带有粘性末端的表达载体 pET-32a(+)及目的基因的制备
            3.2.2 pET-S1 重组质粒的筛选和鉴定
        3.3 重组蛋白的表达
            3.3.1 诱导时间的优化
            3.3.2 IPTG 诱导浓度的优化
            3.3.3 重组蛋白表达形式的鉴定
            3.3.4 咪唑浓度优化
            3.3.5 重组蛋白的纯化
            3.3.6 复性重组蛋白的 SDS-PAGE 分析
            3.3.7 重组蛋白的 Western Blot 分析
    4 讨论
        4.1 S 蛋白的基因表达区域的选择
        4.2 表达系统的选择
        4.3 重组 S 蛋白的纯化与复性
第三章 重组蛋白间接 ELISA 方法的建立
    1 材料
        1.1 试验材料
        1.2 溶液及试剂的配制
    2 试验方法
        2.1 间接 ELISA 方法的操作步骤
        2.2 抗原包被浓度及血清稀释倍数的确定
        2.3 酶标二抗稀释度的确定
        2.4 封闭液的确定
        2.5 封闭时间的确定
        2.6 血清作用时间的确定
        2.7 酶标二抗作用时间的确定
        2.8 显色时间的确定
        2.9 间接 ELISA 阴、阳性血清临界值的确定
        2.10 特异性试验
        2.11 重复性试验
        2.12 临床样品的检测
    3 结果与分析
        3.1 抗原包被浓度及血清稀释倍数的确定
        3.2 酶标二抗稀释度的确定
        3.3 封闭液的确定
        3.4 封闭时间的确定
        3.5 血清作用时间的确定
        3.6 酶标二抗作用时间的确定
        3.7 显色时间的确定
        3.8 间接 ELISA 阴、阳性血清临界值的确定
        3.9 特异性试验
        3.10 重复性试验
        3.11 临床样品的检测
    4 讨论
        4.1 抗原的纯度对 ELISA 的影响
        4.2 抗原包被浓度的影响
        4.3 血清稀释倍数的影响
        4.4 封闭液对 ELISA 的影响
全文总结
参考文献
致谢



本文编号：3497739