产气荚膜梭菌α-β-ε毒素融合蛋白的表达及其免疫原性分析
发布时间：2021-11-16 13:52
产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）又称魏氏梭菌（C.welchii）,呈杆状,革兰阳性菌,广泛存在于自然界中,是一种危害性较强的人畜共患病病原体,主要引起人和多种动物的食物中毒,创伤性坏疽或气性坏疽,分泌性、坏死性或者出血性肠炎,肠毒血症,痢疾等。该病具有发病急、病程短、死亡率高的特点,经常会导致动物的急性死亡,对人类健康及养殖业具有较大的威胁。产气荚膜梭菌本身并无侵袭力,致病性主要由其分泌外毒素作用所致。根据4种主要毒素α（CPA）、β（CPB）、ε（Etx）、iota（Cpi）的产生情况将产气荚膜梭菌划分为A、B、C、D、E 5种毒素型。由于产气荚膜梭菌所致的疾病具有发病急、病程短的特点,往往不能及时发现,导致常规药物很难得到理想效果,疫苗是最主要的预防手段。当前广泛使用的疫苗主要为多联苗。这些疫苗主要成分为灭活菌体或者是类毒素或者是将其混合组成,其具有一些缺点如抗原成分复杂,有效抗原成分少,易引起免疫副反应,重组疫苗可能是一个解决方案。已有研究证明表达产气荚膜梭菌α毒素C末端CPA247-370能够赋予小鼠高的保护率;具有H106...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
产气荚膜梭菌Cp-abx抗原决定簇软件分析
山东农业大学硕士学位论文323.2大肠杆菌表达载体PET28a-abx的构建用PCR扩增产气荚膜梭菌Cp-abx融合基因片段，并用核酸电泳检测，照胶仪中显示出与预期大小的目的条带（如图2A所示），目的条带大小为1941bp，之后，胶回收Cp-abx融合蛋白的PCR产物，送往青岛睿博兴科生物科技有限公司测序。鉴定结果正确后连接克隆载体质粒pEASY-Blunt3，进行双酶切与测序验证，双酶切后进行凝胶电泳检测后出现了特异性目的条带（如图2B所示），测序结果显示，目的片段成功连接在克隆载体上。将双酶切片段，与相同内切酶酶切后的表达质粒pET-28a(+)4℃过夜连接。同样用酶切、测序两种方法进行验证（如图2C所示）。连接大肠杆菌重组表达载体pET-28a(+)，同样和空载体分别用热激法转入BL21（DE3）。用氨苄抗性筛选出阳性转化子，测序鉴定结果准确。结果表明：重组表达质粒pET-28a(+)-Cp-abx成功转化到了BL21（DE3）感受态细胞中。图2产气荚膜梭菌Cp-abx大肠杆菌重组质粒PCR鉴定图Fig.2PCRamplificationofrecombinantplasmidofClostridiumperfringensCp-abx注：(A)PCR扩增Cp-abx电泳图;(B)连接Blunt3载体酶切鉴定图;(C)pET-28a(+)-Cp-abx重组表达质粒酶切鉴定图Note:(A)PCRamplificationofCp-abx;(B)DigestionofrecombinantplasmidBlunt3-Cp-abxbyXhoⅠ和NcoⅠ;(C)DigestionofrecombinantplasmidpET-28a(+)-Cp-abxbyXhoIandNcoI
产气荚膜梭菌α-β-ε毒素融合蛋白的表达及其免疫原性分析333.3Cp-abx融合蛋白在大肠杆菌原核表达、鉴定及纯化培养至对数生长期时加入IPTG诱导不同时间，进行SDS-PAGE检测，图3A为诱导表达不同时间蛋白表达量。可以显示重组质粒pET-28a(+)-Cp-abx转化BL21（DE3）诱导表达的产物可以出现大小约为71.15kDa的特异性条带，和预期表达蛋白大小相符。目的蛋白经纯化后，经SDS-PAGE分析，可见凝胶中只剩一条大小约为71.15kDa的条带。为了进一步鉴定蛋白表达的正确与否，用WesternBlot技术对目标蛋白的HIS标签、ETXH106P进行特异性验证，一抗分别为鼠抗HIS标签单克隆抗体、鼠抗ETXH106P蛋白多克隆抗体；二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，DAB显色试剂盒显色后。可见有71.15kDa大小的条带（如图3B、C所示），与上述SDS-PAGE蛋白条带结果相吻合。因此，在本试验中，Cp-abx融合蛋白，在大肠杆菌原核表达系统中被成功表达，且特异性良好。图3(A)重组蛋白的SDS-PAGE(B)抗HISWesternblot分析(C)抗ETXH106PWesternblot分析Fig.3SDS-PAGE、WesternblottingoftheCp-abxprotein.注：(A)不同诱导时间下的SDS-PAGE鉴定图，M：蛋白Marker；1为阴性对照，2-7依次为表达1h、2h、3h、4h、5h、6h的产物。(B)不同诱导时间下的Westernblotting鉴定图（抗HIS标签）。M：蛋白Marker；1为阴性对照，2-7依次为表达1h、2h-6h的产物。(C)Westernblotting鉴定图。M：蛋白Marker；1：阴性对照；2：抗ETXH106P。Note：(A)SDS–PAGEidentificationatdifferentinductiontimes.M:proteinmarker;lane1,negativecontrol.lanes2-7,transformedwithrecombinantplasmidsafter1,2,3,4,5and6hofIPTGinduction;(B)Westernblottingidentification.M:proteinmarker;lane1,negativecontrol.;lane2-7:transf
【参考文献】：
期刊论文
[1]产气荚膜梭菌β毒素蛋白抗原表位预测及CPB-N蛋白免疫原性分析[J]. 王玉建,商红旗,朱琳,徐煜琳,胡莉萍,朱瑞良. 中国预防兽医学报. 2019(02)
[2]猪魏氏梭菌病的诊断与治疗[J]. 张雪梅. 现代畜牧科技. 2016(01)
[3]A型产气荚膜梭菌α-毒素生产发酵工艺[J]. 吕静,柴同杰,张兴晓,王炳晓. 中国兽医学报. 2010(01)
[4]牛D型产气荚膜梭菌肠毒血症dot-ELISA诊断方法的建立[J]. 李云霄,金鑫,单雪梅,张营,任春宇. 中国兽医科学. 2009(03)
硕士论文
[1]A、C、D型牛产气荚膜梭菌三价类毒素疫苗的初步研制及免疫效果评价[D]. 刘增禄.黑龙江八一农垦大学 2018
[2]灰葡萄孢蛋白激发子BcSpl1诱导番茄抗病机制研究[D]. 张易.中国农业科学院 2015
[3]兔产气荚膜梭菌（A型）α毒素原核表达产物免疫原性分析[D]. 刘家森.东北农业大学 2004
本文编号：3499012
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
产气荚膜梭菌Cp-abx抗原决定簇软件分析
山东农业大学硕士学位论文323.2大肠杆菌表达载体PET28a-abx的构建用PCR扩增产气荚膜梭菌Cp-abx融合基因片段，并用核酸电泳检测，照胶仪中显示出与预期大小的目的条带（如图2A所示），目的条带大小为1941bp，之后，胶回收Cp-abx融合蛋白的PCR产物，送往青岛睿博兴科生物科技有限公司测序。鉴定结果正确后连接克隆载体质粒pEASY-Blunt3，进行双酶切与测序验证，双酶切后进行凝胶电泳检测后出现了特异性目的条带（如图2B所示），测序结果显示，目的片段成功连接在克隆载体上。将双酶切片段，与相同内切酶酶切后的表达质粒pET-28a(+)4℃过夜连接。同样用酶切、测序两种方法进行验证（如图2C所示）。连接大肠杆菌重组表达载体pET-28a(+)，同样和空载体分别用热激法转入BL21（DE3）。用氨苄抗性筛选出阳性转化子，测序鉴定结果准确。结果表明：重组表达质粒pET-28a(+)-Cp-abx成功转化到了BL21（DE3）感受态细胞中。图2产气荚膜梭菌Cp-abx大肠杆菌重组质粒PCR鉴定图Fig.2PCRamplificationofrecombinantplasmidofClostridiumperfringensCp-abx注：(A)PCR扩增Cp-abx电泳图;(B)连接Blunt3载体酶切鉴定图;(C)pET-28a(+)-Cp-abx重组表达质粒酶切鉴定图Note:(A)PCRamplificationofCp-abx;(B)DigestionofrecombinantplasmidBlunt3-Cp-abxbyXhoⅠ和NcoⅠ;(C)DigestionofrecombinantplasmidpET-28a(+)-Cp-abxbyXhoIandNcoI
产气荚膜梭菌α-β-ε毒素融合蛋白的表达及其免疫原性分析333.3Cp-abx融合蛋白在大肠杆菌原核表达、鉴定及纯化培养至对数生长期时加入IPTG诱导不同时间，进行SDS-PAGE检测，图3A为诱导表达不同时间蛋白表达量。可以显示重组质粒pET-28a(+)-Cp-abx转化BL21（DE3）诱导表达的产物可以出现大小约为71.15kDa的特异性条带，和预期表达蛋白大小相符。目的蛋白经纯化后，经SDS-PAGE分析，可见凝胶中只剩一条大小约为71.15kDa的条带。为了进一步鉴定蛋白表达的正确与否，用WesternBlot技术对目标蛋白的HIS标签、ETXH106P进行特异性验证，一抗分别为鼠抗HIS标签单克隆抗体、鼠抗ETXH106P蛋白多克隆抗体；二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，DAB显色试剂盒显色后。可见有71.15kDa大小的条带（如图3B、C所示），与上述SDS-PAGE蛋白条带结果相吻合。因此，在本试验中，Cp-abx融合蛋白，在大肠杆菌原核表达系统中被成功表达，且特异性良好。图3(A)重组蛋白的SDS-PAGE(B)抗HISWesternblot分析(C)抗ETXH106PWesternblot分析Fig.3SDS-PAGE、WesternblottingoftheCp-abxprotein.注：(A)不同诱导时间下的SDS-PAGE鉴定图，M：蛋白Marker；1为阴性对照，2-7依次为表达1h、2h、3h、4h、5h、6h的产物。(B)不同诱导时间下的Westernblotting鉴定图（抗HIS标签）。M：蛋白Marker；1为阴性对照，2-7依次为表达1h、2h-6h的产物。(C)Westernblotting鉴定图。M：蛋白Marker；1：阴性对照；2：抗ETXH106P。Note：(A)SDS–PAGEidentificationatdifferentinductiontimes.M:proteinmarker;lane1,negativecontrol.lanes2-7,transformedwithrecombinantplasmidsafter1,2,3,4,5and6hofIPTGinduction;(B)Westernblottingidentification.M:proteinmarker;lane1,negativecontrol.;lane2-7:transf
【参考文献】：
期刊论文
[1]产气荚膜梭菌β毒素蛋白抗原表位预测及CPB-N蛋白免疫原性分析[J]. 王玉建,商红旗,朱琳,徐煜琳,胡莉萍,朱瑞良. 中国预防兽医学报. 2019(02)
[2]猪魏氏梭菌病的诊断与治疗[J]. 张雪梅. 现代畜牧科技. 2016(01)
[3]A型产气荚膜梭菌α-毒素生产发酵工艺[J]. 吕静,柴同杰,张兴晓,王炳晓. 中国兽医学报. 2010(01)
[4]牛D型产气荚膜梭菌肠毒血症dot-ELISA诊断方法的建立[J]. 李云霄,金鑫,单雪梅,张营,任春宇. 中国兽医科学. 2009(03)
硕士论文
[1]A、C、D型牛产气荚膜梭菌三价类毒素疫苗的初步研制及免疫效果评价[D]. 刘增禄.黑龙江八一农垦大学 2018
[2]灰葡萄孢蛋白激发子BcSpl1诱导番茄抗病机制研究[D]. 张易.中国农业科学院 2015
[3]兔产气荚膜梭菌（A型）α毒素原核表达产物免疫原性分析[D]. 刘家森.东北农业大学 2004
本文编号：3499012
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