核不均一核糖核蛋白K与口蹄疫病毒相互作用调控病毒的复制及其分子机制
发布时间：2021-11-18 09:51
口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virues,FMDV）引起的偶蹄动物的一种烈性传染病,其严重损害畜牧业的生产,每年都造成巨大的经济损失。FMDV属于微RNA病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒属（Aphthovirus）的成员。与微RNA病毒科其他病毒成员一样,FMDV基因组缺乏5’端帽子结构,其蛋白翻译的起始依赖于5’非编码区的内部核糖体进入位点（Internal ribosome entry site,IRES）。越来越多的研究证实,IRES介导翻译的调控是病毒感染的关键步骤,对病毒的毒力、致病性以及组织嗜性具有重要的影响。因此,深入研究病毒IRES元件介导的翻译调控机制,对阐明FMDV的致病机理具有重要意义。在本实验室的前期研究中,通过RNA pulldown方法结合质谱分析筛选获得8个与FMDV IRES相互作用的宿主细胞蛋白。本研究选取其中的hnRNP K蛋白进行深入的研究。hnRNP K属于hnRNP蛋白家族的成员,是一种多功能蛋白,通过与核酸和蛋白相互作用参与细胞的调...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：76 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
口蹄疫病毒基因组结构（引自Gaoetal.2016）
中国农业科学院博士学位论文第一章绪论7接与5"UTR中的S片段和IRES元件相互作用，从而影响FMDV的感染性和复制(GARCA-NUEZetal.,2014)。其中，IRES元件通过同时结合3"UTR的两个茎环结构且以不依赖poly(A)尾的方式与3"UTR相互作用，从而增强IRES活性；而S片段通过依赖poly(A)尾的方式分别与3"UTR的茎环结构相互作用。3"UTR除了直接的RNA-RNA相互作用，其5"-3"末端连接也可能通过蛋白质-蛋白质以及蛋白质-RNA相互作用的方式调控FMDV的翻译(SERRANOetal.,2006)。图1-2口蹄疫病毒基因组5"端非编码区的结构（引自Masonetal.2003）Fig.1-2ThestructureofFMDV5"untranslationregion(RetrievedfromMasonetal.2003)1.2.5口蹄疫病毒的翻译调控元件IRESIRES元件是一个独特的RNA分子，大约450nt，其GC含量较高，具有复杂且稳定的高级结构。目前，根据病毒IRES的结构与功能，可将其分为5类，其中FMDV和EMCV的IRES均属于II型IRES(PILIPENKOetal.,1989;SWEENEYetal.,2012)。FMDVIRES包含4个高度结构化的结构域，结构域II（DomainII）的茎环顶部存在高度保守的UCUUU基序，为PTB蛋白提供结合位点(FAJARDOetal.,2012)；结构域III（DomainIII）是FMDVIRES元件中最大的、处于中间位置的结构域，其顶端区域包括两个保守的GNRA和RAAA（N是任何核苷酸，R代表嘌呤）基序，而中间区域是保守的胞嘧啶富集基序（C-richmotif）(FERNNDEZetal.,2011;LPEZDEQUINTOetal.,2002)，GNRA与RAAA基序对稳定IRES元件的二级结构起着重要作用，修饰GNRA的5"-G或3"-A残基会大大降低FMDVIRES的活性，而RAAA突变将会导致FMDVIRES失去活性(FERNNDEZetal.,2011;LPEZDEQUINTOetal.,2002;ROBERTSONetal.,1999)。此外，结构域III对FMDV复制过程中的RNA-RNA和RNA-蛋白质相互作用中也起着关键作用(FER
中国农业科学院博士学位论文第二章hnRNPK与口蹄疫病毒相互作用调控病毒复制的分子机制24图2-1hnRNPK与FMDVIRES相互作用（A-C）FMDVIRES与不同种属细胞的hnRNPK发生相互作用。BHK-21、IBRS-2、pBK细胞的裂解液分别与生物素标记的FMDVIRES共孵育，未标记FMDVIRES、Biotin-16-UTP和无RNA作为对照。用hnRNPK特异性抗体进行RNApulldown试验和免疫印迹分析。（D-E）竞争结合试验证实hnRNPK与FMDVIRES特异性相互作用。RNApulldown试验中加入不同梯度剂量的未标记RNA（FMDVIRES和酵母tRNA），与生物素标记的FMDVIRES竞争结合hnRNPK，并用hnRNPK抗体进行免疫印迹分析。（F）hnRNPK与FMDVIRES直接的相互作用。原核表达纯化的hnRNPK蛋白与生物素标记的FMDVIRES共孵育，GST蛋白作为对照。用GST抗体进行RNApulldown试验和免疫印迹分析。（G）在FMDV感染细胞中hnRNPK与FMDV基因组RNA的相互作用。FMDV（MOI,1）接种BHK-21细胞6h后收集细胞裂解液，分别用图中显示的抗体进行RNA免疫共沉淀。Fig.2-1InteractionofhnRNPKwiththeFMDVIRES(A-C)TheFMDVIRESinteractswithhnRNPKinvariouscelllines.TheextractsofBHK-21,IBRS-2orpBKcellswereincubatedwiththebiotinylatedFMDVIRES,thenonbiotinylatedFMDVIRES,Biotin-16-UTPornoRNAusedasnegativecontrols.RNApulldownassaysandimmunoblotanalysiswereperformedwithananti-hnRNPKantibody.(D-E)SpecificassociationbetweenhnRNPKandFMDVIRESwasconfirmedbycompetitionassays.VariousamountsofunlabeledRNA(FMDVIRESoryeasttRNA)wereaddedtocompetewiththebiotin-labeledFMDVIRESforbindinghnRNPKinRNA-proteinpulldownassaysandanalyzedbyWesternblottingusingananti-hnRNPKantibody.(F)PurifiedGST-hnRNPK(50μg)wasincubat
【参考文献】：
期刊论文
[1]O型泛亚谱系口蹄疫病毒cDNA感染性克隆的建立[J]. 杨德成,涂亚斌,王海伟,周国辉,于力. 中国预防兽医学报. 2009(01)
本文编号：3502682
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：76 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
口蹄疫病毒基因组结构（引自Gaoetal.2016）
中国农业科学院博士学位论文第一章绪论7接与5"UTR中的S片段和IRES元件相互作用，从而影响FMDV的感染性和复制(GARCA-NUEZetal.,2014)。其中，IRES元件通过同时结合3"UTR的两个茎环结构且以不依赖poly(A)尾的方式与3"UTR相互作用，从而增强IRES活性；而S片段通过依赖poly(A)尾的方式分别与3"UTR的茎环结构相互作用。3"UTR除了直接的RNA-RNA相互作用，其5"-3"末端连接也可能通过蛋白质-蛋白质以及蛋白质-RNA相互作用的方式调控FMDV的翻译(SERRANOetal.,2006)。图1-2口蹄疫病毒基因组5"端非编码区的结构（引自Masonetal.2003）Fig.1-2ThestructureofFMDV5"untranslationregion(RetrievedfromMasonetal.2003)1.2.5口蹄疫病毒的翻译调控元件IRESIRES元件是一个独特的RNA分子，大约450nt，其GC含量较高，具有复杂且稳定的高级结构。目前，根据病毒IRES的结构与功能，可将其分为5类，其中FMDV和EMCV的IRES均属于II型IRES(PILIPENKOetal.,1989;SWEENEYetal.,2012)。FMDVIRES包含4个高度结构化的结构域，结构域II（DomainII）的茎环顶部存在高度保守的UCUUU基序，为PTB蛋白提供结合位点(FAJARDOetal.,2012)；结构域III（DomainIII）是FMDVIRES元件中最大的、处于中间位置的结构域，其顶端区域包括两个保守的GNRA和RAAA（N是任何核苷酸，R代表嘌呤）基序，而中间区域是保守的胞嘧啶富集基序（C-richmotif）(FERNNDEZetal.,2011;LPEZDEQUINTOetal.,2002)，GNRA与RAAA基序对稳定IRES元件的二级结构起着重要作用，修饰GNRA的5"-G或3"-A残基会大大降低FMDVIRES的活性，而RAAA突变将会导致FMDVIRES失去活性(FERNNDEZetal.,2011;LPEZDEQUINTOetal.,2002;ROBERTSONetal.,1999)。此外，结构域III对FMDV复制过程中的RNA-RNA和RNA-蛋白质相互作用中也起着关键作用(FER
中国农业科学院博士学位论文第二章hnRNPK与口蹄疫病毒相互作用调控病毒复制的分子机制24图2-1hnRNPK与FMDVIRES相互作用（A-C）FMDVIRES与不同种属细胞的hnRNPK发生相互作用。BHK-21、IBRS-2、pBK细胞的裂解液分别与生物素标记的FMDVIRES共孵育，未标记FMDVIRES、Biotin-16-UTP和无RNA作为对照。用hnRNPK特异性抗体进行RNApulldown试验和免疫印迹分析。（D-E）竞争结合试验证实hnRNPK与FMDVIRES特异性相互作用。RNApulldown试验中加入不同梯度剂量的未标记RNA（FMDVIRES和酵母tRNA），与生物素标记的FMDVIRES竞争结合hnRNPK，并用hnRNPK抗体进行免疫印迹分析。（F）hnRNPK与FMDVIRES直接的相互作用。原核表达纯化的hnRNPK蛋白与生物素标记的FMDVIRES共孵育，GST蛋白作为对照。用GST抗体进行RNApulldown试验和免疫印迹分析。（G）在FMDV感染细胞中hnRNPK与FMDV基因组RNA的相互作用。FMDV（MOI,1）接种BHK-21细胞6h后收集细胞裂解液，分别用图中显示的抗体进行RNA免疫共沉淀。Fig.2-1InteractionofhnRNPKwiththeFMDVIRES(A-C)TheFMDVIRESinteractswithhnRNPKinvariouscelllines.TheextractsofBHK-21,IBRS-2orpBKcellswereincubatedwiththebiotinylatedFMDVIRES,thenonbiotinylatedFMDVIRES,Biotin-16-UTPornoRNAusedasnegativecontrols.RNApulldownassaysandimmunoblotanalysiswereperformedwithananti-hnRNPKantibody.(D-E)SpecificassociationbetweenhnRNPKandFMDVIRESwasconfirmedbycompetitionassays.VariousamountsofunlabeledRNA(FMDVIRESoryeasttRNA)wereaddedtocompetewiththebiotin-labeledFMDVIRESforbindinghnRNPKinRNA-proteinpulldownassaysandanalyzedbyWesternblottingusingananti-hnRNPKantibody.(F)PurifiedGST-hnRNPK(50μg)wasincubat
【参考文献】：
期刊论文
[1]O型泛亚谱系口蹄疫病毒cDNA感染性克隆的建立[J]. 杨德成,涂亚斌,王海伟,周国辉,于力. 中国预防兽医学报. 2009(01)
本文编号：3502682
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