柔嫩艾美耳球虫配子体基因Etgam56的克隆表达与鉴定

发布时间：2021-11-19 03:25

　　提取柔嫩艾美耳球虫（扬州株）配子体基因组DNA,PCR扩增配子体基因Etgam56,经克隆和序列分析后,优化密码子,连接至pET-28a（+）,构建原核表达载体pET-28a（+）-Etgam56,优化条件进行体外诱导表达,Western blot分析其抗原性。结果显示,Etgam56基因全长1 425 bp,为一个完整开放阅读框,共编码474个氨基酸;体外表达重组蛋白的大小约为56 ku,IPTG终浓度为0.10 mmol/L,37℃诱导3 h时的表达量最高,且主要以包涵体形式存在。Western blot结果显示,该重组蛋白能被6×HIS标签单克隆抗体、柔嫩艾美耳球虫鸡康复血清和毒害艾美耳球虫鸡康复血清识别,表明该重组蛋白为特异性表达的蛋白,具有很好的抗原性和交叉反应性。本研究将为进一步探析柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白的功能与研制鸡球虫基因工程疫苗奠定基础。 

【文章来源】：畜牧与兽医. 2020,52(11)北大核心

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

Etgam 56的PCR扩增

重组质粒的酶切鉴定

在最适表达条件下,大量诱导表达重组蛋白,经HIS标签Ni-NTA亲和层析柱纯化,收集纯化过程中不同时期流出液进行12% SDS-PAGE,结果显示,裂解液中的蛋白能与Ni-NTA较好结合,经3次Washing Buffer洗涤,可有效去除未与Ni-NTA结合的杂蛋白,Elution Buffer可以有效洗脱目的蛋白,纯化效果较好,且复性过程中未发生蛋白降解(图3)。2.6 重组蛋白的鉴定

【参考文献】：
期刊论文
[1]鸡堆型艾美耳球虫gam56基因的克隆及其表达产物的免疫原性分析[J]. 华恩玉,朱玉,汪飞燕,孔令明,刘丹丹,候照峰,许金俊,陶建平.  中国兽医科学. 2019(12)
[2]毒害艾美耳球虫配子体Engam59基因的克隆表达及其表达产物的免疫原性分析[J]. 刘丹丹,曹李琴,朱玉兰,许金俊,陶建平.  中国兽医科学. 2017(12)



本文编号：3504190