CpxAR双组份系统参与胸膜肺炎放线杆菌抵抗高烧温度的机制研究
发布时间：2021-11-19 20:02
胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）是一种重要的动物病原菌,是引起猪传染性胸膜肺炎的主要病原,给集约化养猪业造成巨大的经济损失。猪传染性胸膜肺炎是一种重要的呼吸道传染病,以纤维素性出血性和坏死性胸膜肺炎为特征,可以导致所有年龄段的猪只发生感染。根据细菌表面多糖特别是荚膜多糖的差异,胸膜肺炎放线杆菌可以分为18个血清型。随着90年代规模化养殖业的迅猛发展,该病严重爆发并且迅速流行。该病自1957年由Pattison等首次报道以来,目前已广泛分布于瑞士、丹麦、美国等全世界大多数养猪国家,给现代养猪业带来巨大威胁,被国际公认为危害全球养猪业的重要疫病之一。胸膜肺炎放线杆菌在侵入宿主过程中,会遭遇各种不利条件,因此需要转录调控系统来感知和应答环境信号。猪只感染急性胸膜肺炎后,体温急剧升高至42℃左右,APP仍然能够在高烧温度下生长繁殖,并引起大量猪只发病死亡,但其抵抗高烧温度的机制仍然未知。CpxAR双组份调控系统是革兰氏阴性菌中普遍存在的一种非常重要的双组份调控系统,主要功能是感知和应答包膜的变化,尤其是周质蛋白的错误折叠和聚集。课题组前...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 文献综述
1.1 猪传染性胸膜肺炎概述
1.1.1 病原学
1.1.2 流行病学
1.1.3 临床症状与及病理变化
1.2 高烧温度不利于细菌生存
1.3 细菌维持周质蛋白稳态的机制
1.4 CPXAR双组份是维持周质蛋白稳态的重要调控系统
1.5 IV型菌毛研究进展
1.5.1 IV型菌毛概述
1.5.2 IV型菌毛的结构与组装机制
2 研究目的与意义
3 材料与方法
3.1 材料
3.1.1 菌株、质粒和培养条件
3.1.2 主要试剂
3.1.3 引物
3.2 方法
3.2.1 培养基与抗生素的配制
3.2.2 主要缓冲液及其配制
3.2.3 胸膜肺炎放线杆菌基因缺失株及互补菌株的构建与鉴定
3.2.4 突变株、互补菌株和野生株的体外生长特性研究
3.2.5 透射电镜观察细菌形态
3.2.6 胸膜肺炎放线杆菌RNA的提取
3.2.7 RNA-seq
3.2.8 RNA-Seq数据分析
3.2.9 荧光定量PCR
3.2.10 RT-PCR
3.2.11 Capping RACE
3.2.12 His标签的目的蛋白ApfA的表达纯化
3.2.13 凝胶迁移实验(EMSA)
3.2.14 DNase I足迹法实验
3.2.15 兔源多克隆抗体制备
3.2.16 Western blot
3.2.17 生物被膜实验
3.2.18 细胞黏附实验
3.2.19 高温耐受实验
3.2.20 统计分析
4 结果与分析
4.1 预测菌毛相关基因参与CPXAR双组份调控APP抵抗高烧温度
4.1.1 野生株S4074 和?cpxAR缺失株RNA的提取
4.1.2 转录组测序结果分析
4.1.3 预测菌毛相关基因参与CpxAR双组份调控APP抵抗高烧温度
4.2 IV型菌毛相关基因簇的生物学功能研究
4.2.1 apf和 pil基因簇分析
4.2.2 构建IV型菌毛相关基因缺失株
4.2.3 IV型菌毛相关基因的生物学功能研究
4.2.4 pil基因簇细胞接触表达检测
4.3 CPXAR抑制APFA蛋白表达促进APP抵抗高烧温度
4.3.1 构建双基因缺失菌株
4.3.2 apfA基因参与APP抵抗高烧温度
4.3.3 过量表达的ApfA蛋白易发生聚集
4.3.4 CpxAR双组份抑制apfA基因转录的机制
5 讨论
5.1 预测菌毛相关基因参与 CpxAR 双组份调控 APP 抵抗高烧温度
5.2 胸膜肺炎放线杆菌IV型菌毛由apfABCD和pilMNOPQ 基因簇编码合成
5.3 CpxAR 双组份通过抑制菌毛蛋白 ApfA 的表达,促进 APP 抵抗高烧温度
6 结论
参考文献
附录
个人简历
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]革兰氏阴性菌的Cpx双组分调控系统[J]. 徐乐,周晓辉,何晓亮. 微生物学报. 2014(03)
本文编号：3505762
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 文献综述
1.1 猪传染性胸膜肺炎概述
1.1.1 病原学
1.1.2 流行病学
1.1.3 临床症状与及病理变化
1.2 高烧温度不利于细菌生存
1.3 细菌维持周质蛋白稳态的机制
1.4 CPXAR双组份是维持周质蛋白稳态的重要调控系统
1.5 IV型菌毛研究进展
1.5.1 IV型菌毛概述
1.5.2 IV型菌毛的结构与组装机制
2 研究目的与意义
3 材料与方法
3.1 材料
3.1.1 菌株、质粒和培养条件
3.1.2 主要试剂
3.1.3 引物
3.2 方法
3.2.1 培养基与抗生素的配制
3.2.2 主要缓冲液及其配制
3.2.3 胸膜肺炎放线杆菌基因缺失株及互补菌株的构建与鉴定
3.2.4 突变株、互补菌株和野生株的体外生长特性研究
3.2.5 透射电镜观察细菌形态
3.2.6 胸膜肺炎放线杆菌RNA的提取
3.2.7 RNA-seq
3.2.8 RNA-Seq数据分析
3.2.9 荧光定量PCR
3.2.10 RT-PCR
3.2.11 Capping RACE
3.2.12 His标签的目的蛋白ApfA的表达纯化
3.2.13 凝胶迁移实验(EMSA)
3.2.14 DNase I足迹法实验
3.2.15 兔源多克隆抗体制备
3.2.16 Western blot
3.2.17 生物被膜实验
3.2.18 细胞黏附实验
3.2.19 高温耐受实验
3.2.20 统计分析
4 结果与分析
4.1 预测菌毛相关基因参与CPXAR双组份调控APP抵抗高烧温度
4.1.1 野生株S4074 和?cpxAR缺失株RNA的提取
4.1.2 转录组测序结果分析
4.1.3 预测菌毛相关基因参与CpxAR双组份调控APP抵抗高烧温度
4.2 IV型菌毛相关基因簇的生物学功能研究
4.2.1 apf和 pil基因簇分析
4.2.2 构建IV型菌毛相关基因缺失株
4.2.3 IV型菌毛相关基因的生物学功能研究
4.2.4 pil基因簇细胞接触表达检测
4.3 CPXAR抑制APFA蛋白表达促进APP抵抗高烧温度
4.3.1 构建双基因缺失菌株
4.3.2 apfA基因参与APP抵抗高烧温度
4.3.3 过量表达的ApfA蛋白易发生聚集
4.3.4 CpxAR双组份抑制apfA基因转录的机制
5 讨论
5.1 预测菌毛相关基因参与 CpxAR 双组份调控 APP 抵抗高烧温度
5.2 胸膜肺炎放线杆菌IV型菌毛由apfABCD和pilMNOPQ 基因簇编码合成
5.3 CpxAR 双组份通过抑制菌毛蛋白 ApfA 的表达,促进 APP 抵抗高烧温度
6 结论
参考文献
附录
个人简历
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]革兰氏阴性菌的Cpx双组分调控系统[J]. 徐乐,周晓辉,何晓亮. 微生物学报. 2014(03)
本文编号：3505762
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3505762.html
