中国美利奴绵羊PLCζ基因的克隆及表达研究

发布时间：2021-11-21 06:14

　　目的：中国美利奴绵羊是我国新疆特有的肉毛兼用绵羊品种之一，其屠宰加工量非常大。然而，卵巢组织的回收利用率并不高，核移植产生的克隆动物或转基因动物更是少之又少。目前多使用蛋白激酶抑制剂或蛋白质合成抑制剂来人工激活卵母细胞，其缺点是不能特异地抑制细胞周期中某种特定激酶的活性，或某个特定蛋白质的合成。这种方式可能影响卵母细胞的其他功能，或是对卵母细胞激活后的发育产生不利的影响，进而对卵母细胞激活后的发育可能产生有害的影响。因此，需要一种全新的卵母细胞激活制剂，它既不使用蛋白的合成抑制剂又不使用蛋白磷酸化抑制剂，并可通过单一增加Ca²⁺来激活卵母细胞。它的获得将能有效地提高优质囊胚的产出效率。本实验的目的在于探究磷脂酶Czeta（PLCζ）是否可以作为一种新的卵母细胞激活物质。方法：（1）用TRIzol法提取了美利奴绵羊睾丸组织总RNA，通过反转录得到了cDNA，以cDNA为模板通过PCR扩增得到了PLCζ基因;（2）经过T/A克隆将PLCζ基因与T载体连接，构建了克隆载体，然后通过双酶切，将PLCζ基因与原核表达载体pCzn1以及pEGFP-N1真核表达载体连接；（3）... 

【文章来源】：石河子大学新疆维吾尔自治区 211工程院校

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩写词表
前言
第一章 文献综述
    1 磷脂酶 C 的研究进展
        1.1 磷脂酶 C 发现
        1.2 磷脂酶 C 的分类
    2 受精中 Ca ~(2+)释放机制的假说
        2.1 受体控制假说
        2.2 精子因子假说
    3 卵母细胞的激活方法
        3.1 物理激活
        3.2 化学激活
        3.3 联合激活
    4 PLCζ的特异之处
        4.1 E F 结构域具有较高的 Ca ~(2+) 敏感性
        4.2 PLCζ的 C2 区域对 Ca ~(2+) 振荡有重要作用
        4.3 PLCζ的 XY 连接结构具有靶向定位作用
        4.4 精子 PLCζ的缺陷与雄性不育
    5 研究目的及意义
第二章 实验内容
    实验一 美利奴绵羊 PLCζ基因的克隆及序列分析
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果
            2.1 PLCζ基因的扩增与克隆
            2.2 PLCζ蛋白基因核苷酸及推导的氨基酸序列分析
            2.3 PLCζ蛋白基因的同源性比对及系统进化树的构建
        3 讨论
        4 小结
    实验二 美利奴绵羊 PLCζ基因的原核表达载体的构建与表达
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果
            2.1 目的基因的扩增
            2.2 重组表达质粒的鉴定
            2.3 原核产物的表达
            2.4 融合蛋白的纯化和 WB 分析
        3 讨论
        4 小结
    实验三 美利奴绵羊 PL Cζ基因真核表达载体的构建及其表达研究
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果
            2.1 目的基因的扩增
            2.2 pEGFP- N1 - PLCζ重组表达质粒的鉴定
            2.3 pEGFP- N1- PLCζ重组表达质粒转染 293T 细胞
            2.4 pEGFP- N1 - PLCζ重组表达质粒转染绵羊胎儿成纤维细胞
        3 讨论
        4 小结
    试验四 美利奴绵羊 PLCζ基因在卵母细胞中表达的初步研究
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2. 结果
            2.1 卵母细胞的体外培养
            2.2 卵母细胞胞质内质粒的显微注射
        3. 讨论
        4. 小结
全文总结
创新点
参考文献
致谢
作者简介
导师评阅表


【参考文献】：
期刊论文
[1]p21-EGFP融合基因表达载体与卵母细胞的表达定位[J]. 武迪迪,张杰,具英花,宗志宏,李雪松,于秉治.  贵阳医学院学报. 2007(01)
[2]绵羊精子提取物对卵母细胞的孤雌激活作用[J]. 赛务加甫,张立,彭新荣,郭志林,杨丽,李向臣,何宽军,安志兴,张涌.  西北农林科技大学学报(自然科学版). 2006(07)
[3]蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮（CHX）对猪卵母细胞体外成熟的影响[J]. 李光鹏,孟庆刚,魏鹏,于元松,常仲乐,谭景和.  动物学报. 2001(06)



本文编号：3508943