猪Delta冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒多重PCR检测方法的建立和应用
发布时间：2021-11-21 15:56
旨在建立快速准确检测与猪腹泻相关的猪Delta冠状病毒（PDCoV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PRoV）多重PCR检测方法。针对PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计了4对特异性引物,分别扩增PDCoV N基因（447 bp）、PEDV M基因（204 bp）、TGEV M基因（612 bp）、PRoV VP6基因（329 bp）,经过对反应条件的优化,成功建立了能同时特异性检测PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR,且特异性好。应用该检测方法对上海及周边地区养殖场临床猪腹泻病料进行检测,结果检出PEDV阳性样品16份,其中PEDV和TGEV混合感染1份,PDCoV和PRoV均未检出,与单一RT-PCR检测结果完全吻合。该快速检测方法的成功建立,将有助于提高对PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的病原学调查和疾病监测,为生态养殖提供技术储备。
【文章来源】：畜牧与兽医. 2020,52(09)北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
多重 RT-PCR 退火温度的优化
在20 μL多重RT-PCR反应体系中,把退火温度固定为51.1 ℃,将4对上下游特异性引物的用量分别设置成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 pmol/μL的梯度,其他条件固定不变,进行多重RT-PCR,选取最佳引物浓度。如图2所示,选取4条扩增条带最为清晰且用量最少的为最佳引物浓度:0.2 pmol/μL。2.3 多重RT-PCR最佳循环数的确定
在20 μL多重RT-PCR反应体系中,把退火温度固定为51.1 ℃,把引物浓度固定为0.2 pmol/μL,其他条件保持不变,将循环数分别设置为25、30、35、40和45个循环,进行多重RT-PCR。结果如图3所示,当循环数为35时,耗时较少且能扩增出较为清晰的目的条带,因此选取35个循环数为最佳循环数。经过多次反应条件的优化,确定多重RT-PCR的反应体系。20 μL PCR反应体系:2 × green taq mix 10 μL,4对上下游引物均0.2 μL(终浓度为0.2 pmol/μL),4种重组质粒等比例混合样品1 μL,去离子水补足20 μL。PCR扩增程序:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s,51.1 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35个循环;72 ℃延伸5 min;16 ℃ 终止2 min。
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪Delta冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 韦学雷,梁青青,曹贝贝,张君涛,韩丽,兰培英,胡慧. 中国兽医学报. 2018(01)
[2]猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR诊断方法的建立及初步应用[J]. 韩丽,周雍,李炳晓,曹贝贝,梁青青,张利卫,胡慧. 中国兽医科学. 2017(05)
[3]猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒一步法双重RT-PCR检测方法的建立与应用[J]. 胡鸿惠,南文金,黄健强,吴静波,彭国良. 中国畜牧兽医. 2016(09)
[4]新现猪Delta冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用[J]. 张帆帆,宋德平,周信荣,黄冬艳,李安琪,彭棋,陈燕君,吴琼,何后军,唐玉新. 中国农业科学. 2016(07)
[5]猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A型轮状病毒多重RT-PCR方法的建立及其应用[J]. 李丽敏,朱卫霞,王晓波,魏艳秋,张鹤,张义明,宋勤叶. 中国兽医学报. 2016(02)
[6]四川部分猪场PEDV、TGEV、GARV和PKV感染状况调查[J]. 曹恭貌,张斌,岳华,费磊,任玉鹏. 动物医学进展. 2016(01)
[7]猪Deltacoronavirus RT-PCR检测方法的建立及其应用[J]. 逄凤娇,俞正玉,何孔旺,徐向伟,郭容利,温立斌,姜平,李彬. 中国预防兽医学报. 2015(09)
[8]豫南地区规模化猪场仔猪腹泻病毒性病原感染情况调查[J]. 郭晓秋,曲哲会,陈宏智,刘涛,易本驰. 畜牧与兽医. 2015(07)
[9]山东省部分地区仔猪病毒性腹泻流行病学调查[J]. 薛瑞雪,田野,田夫林,张月,孙振,陈超,姜世金,陈书民. 中国预防兽医学报. 2015(04)
[10]连云港市规模猪场猪流行性腹泻流行病学调查[J]. 单玉平,王益军,孙军防,李锋,张明敬. 畜牧与兽医. 2014(09)
本文编号：3509798
【文章来源】：畜牧与兽医. 2020,52(09)北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
多重 RT-PCR 退火温度的优化
在20 μL多重RT-PCR反应体系中,把退火温度固定为51.1 ℃,将4对上下游特异性引物的用量分别设置成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 pmol/μL的梯度,其他条件固定不变,进行多重RT-PCR,选取最佳引物浓度。如图2所示,选取4条扩增条带最为清晰且用量最少的为最佳引物浓度:0.2 pmol/μL。2.3 多重RT-PCR最佳循环数的确定
在20 μL多重RT-PCR反应体系中,把退火温度固定为51.1 ℃,把引物浓度固定为0.2 pmol/μL,其他条件保持不变,将循环数分别设置为25、30、35、40和45个循环,进行多重RT-PCR。结果如图3所示,当循环数为35时,耗时较少且能扩增出较为清晰的目的条带,因此选取35个循环数为最佳循环数。经过多次反应条件的优化,确定多重RT-PCR的反应体系。20 μL PCR反应体系:2 × green taq mix 10 μL,4对上下游引物均0.2 μL(终浓度为0.2 pmol/μL),4种重组质粒等比例混合样品1 μL,去离子水补足20 μL。PCR扩增程序:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s,51.1 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35个循环;72 ℃延伸5 min;16 ℃ 终止2 min。
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪Delta冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 韦学雷,梁青青,曹贝贝,张君涛,韩丽,兰培英,胡慧. 中国兽医学报. 2018(01)
[2]猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR诊断方法的建立及初步应用[J]. 韩丽,周雍,李炳晓,曹贝贝,梁青青,张利卫,胡慧. 中国兽医科学. 2017(05)
[3]猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒一步法双重RT-PCR检测方法的建立与应用[J]. 胡鸿惠,南文金,黄健强,吴静波,彭国良. 中国畜牧兽医. 2016(09)
[4]新现猪Delta冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用[J]. 张帆帆,宋德平,周信荣,黄冬艳,李安琪,彭棋,陈燕君,吴琼,何后军,唐玉新. 中国农业科学. 2016(07)
[5]猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A型轮状病毒多重RT-PCR方法的建立及其应用[J]. 李丽敏,朱卫霞,王晓波,魏艳秋,张鹤,张义明,宋勤叶. 中国兽医学报. 2016(02)
[6]四川部分猪场PEDV、TGEV、GARV和PKV感染状况调查[J]. 曹恭貌,张斌,岳华,费磊,任玉鹏. 动物医学进展. 2016(01)
[7]猪Deltacoronavirus RT-PCR检测方法的建立及其应用[J]. 逄凤娇,俞正玉,何孔旺,徐向伟,郭容利,温立斌,姜平,李彬. 中国预防兽医学报. 2015(09)
[8]豫南地区规模化猪场仔猪腹泻病毒性病原感染情况调查[J]. 郭晓秋,曲哲会,陈宏智,刘涛,易本驰. 畜牧与兽医. 2015(07)
[9]山东省部分地区仔猪病毒性腹泻流行病学调查[J]. 薛瑞雪,田野,田夫林,张月,孙振,陈超,姜世金,陈书民. 中国预防兽医学报. 2015(04)
[10]连云港市规模猪场猪流行性腹泻流行病学调查[J]. 单玉平,王益军,孙军防,李锋,张明敬. 畜牧与兽医. 2014(09)
本文编号：3509798
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