副猪嗜血杆菌Nagasaki和SW114株差异分泌蛋白的筛选与鉴定
发布时间：2021-11-24 14:07
副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis, Hps）属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属,是猪上呼吸道的常在菌,该菌引起的感染给养猪生产带来极大的损失。该菌血清型众多,毒力因子复杂,到目前为止发现了一些副猪嗜血杆菌的毒力因子,但针对不同致病力副猪嗜血杆菌分泌蛋白的差异研究报道甚少。本试验选取两株不同致病力副猪嗜血杆菌Nagasaki和SW114菌株作为研究对象,比较其生长特性及致病力,采用蛋白质组学技术比较并鉴定其对数期差异分泌蛋白质,同时利用荧光定量PCR技术分析差异分泌蛋白基因转录水平,具体研究内容如下：1副猪嗜血杆菌Nagasaki和SW114株生长特性和致病力的比较本试验采用比浊法和平板活菌计数两种方法测量了Nagasaki和SW114株的生长曲线,结果得知对数期SW114株生长速度明显快于Nagasaki株,SW114株稳定期持续时间约为9h,长于Nagasaki株的6h,当OD600=0.6时,两菌株都处于对数生长期。以体重20-22g 4-8周龄雌性BALB/c小鼠为试验动物,采用改进寇氏法钡Nagasaki和SW114株的半数致死量,结果Nagasaki株的半数致死量...
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略词表
第一部分 文献综述
1 副猪嗜血杆菌
1.1 副猪嗜血杆菌及其血清分型
1.2 副猪嗜血杆菌致病机制
1.3 副猪嗜血杆菌的毒力因子
1.3.1 6-P-葡萄糖酸脱氢酶
1.3.2 脂寡糖
1.3.3 细胞膨胀致死毒素
1.3.4 免疫球蛋白A蛋白酶
1.3.5 荚膜
1.3.6 菌毛
1.3.7 孔蛋白家族蛋白
1.3.8 V型蛋白分泌系统
1.3.9 单体自转运蛋白
1.3.10 毒力相关的三聚体自转运蛋白
1.4 副猪嗜血杆菌毒力因子鉴定途径
1.4.1 通过构建缺失突变株鉴别副猪嗜血毒力因子
1.4.2 通过不同毒力菌株的比较或者特定培养条件下的比较鉴定毒力因子
2 蛋白质组学概述
2.1 蛋白质组学的产生及其研究内容
2.2 蛋白质组学技术路线
2.2.1 双向凝胶电泳
2.2.2 质谱技术
2.2.3 蛋白质组生物信息学
2.3 蛋白质组学技术在细菌蛋白筛选方面的应用
2.3.1 筛选疫苗候选蛋白及发现新蛋白
2.3.2 筛选病原菌毒力蛋白
2.3.3 筛选耐药机制相关蛋白
3 细菌分泌蛋白组研究进展
4 研究目的及意义
第二部分 实验研究
第一章 副猪嗜血杆菌Nagasaki和SW114株生长特性及致病力比较
1 试验材料
1.1 试验菌株
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器
1.4 实验动物
2 试验方法
2.1 Nagasaki和SW114株生长曲线测量
2.1.1 菌液OD_(600)的测定
2.1.2 平板活菌计数
2.2 Nagasaki和SW114株致病力比较
2.2.1 预试验
2.2.2 正式试验
2.2.3 半数致死量的计算
3 试验结果
3.1 Nagasaki和SW114株生长曲线
3.2 预试验结果
3.3 Nagasaki和SW114株的致病力比较
4 讨论
5 小结
第二章 副猪嗜血杆菌Nagasaki和SW114株分泌蛋白的差异分析
1 试验材料
1.1 试验菌株
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器
2 试验方法
2.1 分泌蛋白样品的制备
2.2 分泌蛋白样品浓度测定
2.2.1 分泌蛋白样品的溶解
2.2.2 Bradford法定量
2.3 等点聚焦
2.3.1 胶条的准备
2.3.2 上样
2.3.3 放置胶条
2.3.4 加矿物油
2.3.5 设置程序
2.4 胶条的平衡、转移及SDS-PAGE
2.4.1 胶条的平衡
2.4.2 胶条的转移
2.4.3 SDS-PAGE
2.5 考马氏亮蓝G250染色与脱色
2.6 双向电泳凝胶图像扫描
2.7 图谱分析及差异蛋白筛选
2.8 差异蛋白质谱鉴定及数据库搜索
2.8.1 质谱鉴定
2.8.2 数据库搜索
3 结果
3.1 蛋白定量结果
3.2 组内一致性分析
3.3 双向电泳凝胶图像的扫描及差异蛋白点的筛选
3.4 差异蛋白的质谱鉴定
4 讨论
4.1 关于双向电泳图谱的构建
4.2 关于凝胶图像的分析
4.3 关于筛选的差异蛋白
5 小结
第三章 副猪嗜血杆菌差异分泌蛋白转录水平的研究
1 试验材料
1.1 试验菌株
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器
2 试验方法
2.1 副猪嗜血杆菌SW114和Nagasaki株总RNA的抽提
2.2 cDNA的合成
2.3 引物合成
2.4 荧光定量PCR检测
2.4.1 标准曲线的绘制
2.4.2 扩增曲线的建立
2.4.3 相对转录水平的计算
3 结果
3.1 抽提RNA浓度测定及纯度鉴定
3.2 扩增效率的建立
3.3 16sRNA、AidA、ompD15和AfuA扩增曲线
3.4 16sRNA、AidA、ompD15和AfuA熔解曲线的建立
3.5 相对转录水平差异分析
4 讨论
5 小结
结论
参考文献
致谢
读研期间发表论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]实时荧光定量PCR技术研究进展及应用[J]. 吴婷,陈金梅,李莹. 大家健康(学术版). 2014(04)
[2]血小板蛋白质组学的研究进展[J]. 杨义玲,刘文君. 中国实验血液学杂志. 2012(03)
[3]应用蛋白质组学的方法分析缺铁培养对化脓性链球菌MGAS5005的影响[J]. 吕洁,余光创,孙正华,王南杰,朱颖,王红翠,孙雪松. 微生物学通报. 2012(04)
[4]蛋白质组学研究的有效工具——双向电泳鉴定技术[J]. 张颖,杨舸. 重庆文理学院学报(自然科学版). 2010(05)
[5]蛋白质组学研究的相关技术进展[J]. 冯雪,王彬,黄占景,沈银柱. 生物学教学. 2010(03)
[6]蛋白质组学及其技术发展[J]. 王英超,党源,李晓艳,王兴龙. 生物技术通讯. 2010(01)
[7]副猪嗜血杆菌感染豚鼠试验及在其体内的分布[J]. 高鹏程,储岳峰,赵萍,贺英,逯忠新. 畜牧兽医学报. 2009(09)
[8]荧光定量PCR技术及其在科研中的应用[J]. 朱捷,杨成君,王军. 生物技术通报. 2009(02)
[9]蛋白质组分析技术研究进展[J]. 刘立国,陆慧君,贺文琦,邓旭明. 动物医学进展. 2008(01)
[10]柱状黄杆菌强毒株和弱毒株胞外蛋白中差异蛋白的初步鉴定[J]. 刘国勇,聂品. 中国水产科学. 2007(05)
博士论文
[1]副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究[D]. 蔡旭旺.华中农业大学 2006
硕士论文
[1]副猪嗜血杆菌分离鉴定及疫苗种用特性研究[D]. 韦剑锋.四川农业大学 2013
[2]副猪嗜血杆菌的分离鉴定及蜂胶疫苗的免疫保护效力研究[D]. 钟霏.四川农业大学 2012
[3]副猪嗜血杆菌自转运蛋白AT1的功能研究[D]. 刘莉.华中农业大学 2011
[4]HPS自转运蛋白的免疫原性及其与宿主细胞相互作用研究[D]. 张玉娟.华中农业大学 2011
[5]柔嫩艾美耳球虫菱形蛋白样蛋白酶（EtROMs）基因的克隆及不同发育阶段转录水平研究[D]. 王洪成.南京农业大学 2010
[6]PmrA对伤寒沙门菌高渗应激后期基因表达调节作用[D]. 高宇琳.江苏大学 2009
[7]猪链球菌2型不同温度条件下分泌蛋白的差异研究[D]. 谢春艳.华中农业大学 2008
本文编号：3516131
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略词表
第一部分 文献综述
1 副猪嗜血杆菌
1.1 副猪嗜血杆菌及其血清分型
1.2 副猪嗜血杆菌致病机制
1.3 副猪嗜血杆菌的毒力因子
1.3.1 6-P-葡萄糖酸脱氢酶
1.3.2 脂寡糖
1.3.3 细胞膨胀致死毒素
1.3.4 免疫球蛋白A蛋白酶
1.3.5 荚膜
1.3.6 菌毛
1.3.7 孔蛋白家族蛋白
1.3.8 V型蛋白分泌系统
1.3.9 单体自转运蛋白
1.3.10 毒力相关的三聚体自转运蛋白
1.4 副猪嗜血杆菌毒力因子鉴定途径
1.4.1 通过构建缺失突变株鉴别副猪嗜血毒力因子
1.4.2 通过不同毒力菌株的比较或者特定培养条件下的比较鉴定毒力因子
2 蛋白质组学概述
2.1 蛋白质组学的产生及其研究内容
2.2 蛋白质组学技术路线
2.2.1 双向凝胶电泳
2.2.2 质谱技术
2.2.3 蛋白质组生物信息学
2.3 蛋白质组学技术在细菌蛋白筛选方面的应用
2.3.1 筛选疫苗候选蛋白及发现新蛋白
2.3.2 筛选病原菌毒力蛋白
2.3.3 筛选耐药机制相关蛋白
3 细菌分泌蛋白组研究进展
4 研究目的及意义
第二部分 实验研究
第一章 副猪嗜血杆菌Nagasaki和SW114株生长特性及致病力比较
1 试验材料
1.1 试验菌株
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器
1.4 实验动物
2 试验方法
2.1 Nagasaki和SW114株生长曲线测量
2.1.1 菌液OD_(600)的测定
2.1.2 平板活菌计数
2.2 Nagasaki和SW114株致病力比较
2.2.1 预试验
2.2.2 正式试验
2.2.3 半数致死量的计算
3 试验结果
3.1 Nagasaki和SW114株生长曲线
3.2 预试验结果
3.3 Nagasaki和SW114株的致病力比较
4 讨论
5 小结
第二章 副猪嗜血杆菌Nagasaki和SW114株分泌蛋白的差异分析
1 试验材料
1.1 试验菌株
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器
2 试验方法
2.1 分泌蛋白样品的制备
2.2 分泌蛋白样品浓度测定
2.2.1 分泌蛋白样品的溶解
2.2.2 Bradford法定量
2.3 等点聚焦
2.3.1 胶条的准备
2.3.2 上样
2.3.3 放置胶条
2.3.4 加矿物油
2.3.5 设置程序
2.4 胶条的平衡、转移及SDS-PAGE
2.4.1 胶条的平衡
2.4.2 胶条的转移
2.4.3 SDS-PAGE
2.5 考马氏亮蓝G250染色与脱色
2.6 双向电泳凝胶图像扫描
2.7 图谱分析及差异蛋白筛选
2.8 差异蛋白质谱鉴定及数据库搜索
2.8.1 质谱鉴定
2.8.2 数据库搜索
3 结果
3.1 蛋白定量结果
3.2 组内一致性分析
3.3 双向电泳凝胶图像的扫描及差异蛋白点的筛选
3.4 差异蛋白的质谱鉴定
4 讨论
4.1 关于双向电泳图谱的构建
4.2 关于凝胶图像的分析
4.3 关于筛选的差异蛋白
5 小结
第三章 副猪嗜血杆菌差异分泌蛋白转录水平的研究
1 试验材料
1.1 试验菌株
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器
2 试验方法
2.1 副猪嗜血杆菌SW114和Nagasaki株总RNA的抽提
2.2 cDNA的合成
2.3 引物合成
2.4 荧光定量PCR检测
2.4.1 标准曲线的绘制
2.4.2 扩增曲线的建立
2.4.3 相对转录水平的计算
3 结果
3.1 抽提RNA浓度测定及纯度鉴定
3.2 扩增效率的建立
3.3 16sRNA、AidA、ompD15和AfuA扩增曲线
3.4 16sRNA、AidA、ompD15和AfuA熔解曲线的建立
3.5 相对转录水平差异分析
4 讨论
5 小结
结论
参考文献
致谢
读研期间发表论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]实时荧光定量PCR技术研究进展及应用[J]. 吴婷,陈金梅,李莹. 大家健康(学术版). 2014(04)
[2]血小板蛋白质组学的研究进展[J]. 杨义玲,刘文君. 中国实验血液学杂志. 2012(03)
[3]应用蛋白质组学的方法分析缺铁培养对化脓性链球菌MGAS5005的影响[J]. 吕洁,余光创,孙正华,王南杰,朱颖,王红翠,孙雪松. 微生物学通报. 2012(04)
[4]蛋白质组学研究的有效工具——双向电泳鉴定技术[J]. 张颖,杨舸. 重庆文理学院学报(自然科学版). 2010(05)
[5]蛋白质组学研究的相关技术进展[J]. 冯雪,王彬,黄占景,沈银柱. 生物学教学. 2010(03)
[6]蛋白质组学及其技术发展[J]. 王英超,党源,李晓艳,王兴龙. 生物技术通讯. 2010(01)
[7]副猪嗜血杆菌感染豚鼠试验及在其体内的分布[J]. 高鹏程,储岳峰,赵萍,贺英,逯忠新. 畜牧兽医学报. 2009(09)
[8]荧光定量PCR技术及其在科研中的应用[J]. 朱捷,杨成君,王军. 生物技术通报. 2009(02)
[9]蛋白质组分析技术研究进展[J]. 刘立国,陆慧君,贺文琦,邓旭明. 动物医学进展. 2008(01)
[10]柱状黄杆菌强毒株和弱毒株胞外蛋白中差异蛋白的初步鉴定[J]. 刘国勇,聂品. 中国水产科学. 2007(05)
博士论文
[1]副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究[D]. 蔡旭旺.华中农业大学 2006
硕士论文
[1]副猪嗜血杆菌分离鉴定及疫苗种用特性研究[D]. 韦剑锋.四川农业大学 2013
[2]副猪嗜血杆菌的分离鉴定及蜂胶疫苗的免疫保护效力研究[D]. 钟霏.四川农业大学 2012
[3]副猪嗜血杆菌自转运蛋白AT1的功能研究[D]. 刘莉.华中农业大学 2011
[4]HPS自转运蛋白的免疫原性及其与宿主细胞相互作用研究[D]. 张玉娟.华中农业大学 2011
[5]柔嫩艾美耳球虫菱形蛋白样蛋白酶（EtROMs）基因的克隆及不同发育阶段转录水平研究[D]. 王洪成.南京农业大学 2010
[6]PmrA对伤寒沙门菌高渗应激后期基因表达调节作用[D]. 高宇琳.江苏大学 2009
[7]猪链球菌2型不同温度条件下分泌蛋白的差异研究[D]. 谢春艳.华中农业大学 2008
本文编号：3516131
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3516131.html
