猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3蛋白单克隆抗体制备与抗原表位鉴定

发布时间：2021-11-24 20:42

　　猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）属于套式病毒目（Nidovirales）、动脉炎病毒科（Arteriviridae）、动脉炎病毒属（Arterivirus）,主要的临床表现为发烧,早产,流产,死胎,木乃伊胎等猪群的繁殖障碍和呼吸道症状。GP3蛋白是病毒粒子囊膜的组成部分,是该病毒的次要结构蛋白之一,是由ORF3基因编码的糖基化糖蛋白,少量存在病毒粒子中,GP3能够诱导机体产生中和抗体,而且在细胞受体识别病毒粒子以及在病毒变异等方面具有重要意义。噬菌体展示技术研究抗原表位不仅可以证明抗原分子的具体结构与功能,还可以揭示抗原抗体的反应机制,并可广泛的用于研发多种多肽疫苗和新型药物。因此,本实验以PRRSV-HH08株为研究对象,制备了GP3蛋白单克隆抗体并对其抗原表位,进行了初步的研究。本实验以原核表达的PRRSV-GP3蛋白为免疫源免疫小鼠,通过常规方法进行细胞融合,3轮亚克隆后,成功筛选出1株抗PRRSV GP3蛋白的单克隆抗体,经亚类鉴定为IgG2a型,该株抗体的稳定性与特异... 

【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校

【文章页数】：50 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
CONTENTS
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)概述
        1.1.1 PRRSV的流行病学特征
        1.1.2 PRRSV的病原学特征
        1.1.3 PRRSV的基因组特征
        1.1.4 PRRSV的培养与增殖
        1.1.5 PRRSV GP3蛋白的介绍
        1.1.6 GP3在PRRS新型疫苗研制中的作用
    1.2 抗原表位的研究方法
        1.2.1 抗原表位的概述
        1.2.2 T细胞抗原表位的研究手段
        1.2.3 B细胞抗原表位的研究手段
        1.2.4 表位疫苗的研究进展
    1.3 研究目的和意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株、载体与质粒
        2.1.2 细胞与病毒
        2.1.3 实验动物
        2.1.4 主要试剂
        2.1.5 标准参照物
        2.1.6 主要仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 PRRSV-GP3免疫抗原的制备
        2.2.2 PRRSV GP3蛋白单克隆抗体制备
        2.2.3 PRRSV GP3蛋白单克隆抗体的特性鉴定
        2.2.4 应用噬菌体展示技术筛选PRRSV GP3蛋白抗原表位
3 结果与分析
    3.1 PRRSV GP3蛋白的诱导表达及纯化
        3.1.1 PRRSV GP3蛋白的诱导表达
        3.1.2 PRRSV GP3蛋白的纯化
    3.2 PRRSV GP3蛋白单克隆抗体制备及特性鉴定
        3.2.1 免疫Balb/C小鼠血清抗体效价测定
        3.2.2 最佳抗原抗体工作浓度的确定
        3.2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选
        3.2.4 杂交瘤细胞培养上清效价的测定
        3.2.5 单克隆抗体亚类鉴定
        3.2.6 腹水制备与纯化
        3.2.7 纯化后腹水抗体效价的测定
        3.2.8 间接免疫荧光方法鉴定单克隆抗体与PRRSV的结合情况
        3.2.9 免疫印迹方法鉴定单克隆抗体与GP3蛋白的结合情况
        3.2.10 单克隆抗体特异性分析
    3.3 PRRSV GP3蛋白抗原表位的筛选
        3.3.1 噬菌体筛选与扩增
        3.3.2 亲和能力检测与测序
        3.3.3 竞争性阻断实验
4 讨论
    4.1 目的基因的选择
    4.2 免疫抗原和筛选抗原的选择
    4.3 Balb/C小鼠的免疫
    4.4 细胞融合与克隆
    4.5 抗GP3蛋白单克隆抗体1F7的特性分析
    4.6 单克隆抗体腹水制备与纯化
    4.7 通过噬菌体展示技术筛选PRRSV GP3蛋白抗原表位
5 结论
致谢
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的免疫学和免疫逃避研究进展[J]. 张松林,韩静,李峰,高三阳,刘磊,马永彪,沈志强.  病毒学报. 2012(06)
[2]表位疫苗的设计及应用研究进展[J]. 赵德,冯磊,张强,郭建宏,高凤山.  生命科学. 2012(02)
[3]高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定[J]. 张善瑞,周艳君,朱建平,童武,姜一峰,童光志.  中国预防兽医学报. 2011(07)
[4]抗原表位研究方法进展[J]. 宋帅,李春玲,贾爱卿,杨冬霞,李淼.  动物医学进展. 2010(12)
[5]猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体研究进展[J]. 李清州,达龙珠,鲍登克,陈海燕,杨春英,刘毓霞,乔松林.  动物医学进展. 2010(12)
[6]猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展[J]. 刘萍,陈苗苗,乔莉萍,王凡,刘学荣,牟克斌,黄银君.  中国畜牧兽医. 2010(01)
[7]猪瘟病毒E2基因噬菌体展示多肽库的构建及表位鉴定[J]. 徐和敏,王琴,徐璐,范学政.  畜牧兽医学报. 2010(01)
[8]MyD88-铜绿假单胞菌表位核酸疫苗的构建及其真核表达[J]. 陈建国,苏兆亮,柳迎昭,王胜军,黄新祥,邵启祥,许化溪.  细胞与分子免疫学杂志. 2009(03)
[9]幽门螺杆菌双亚单位表位疫苗的构建及免疫原性研究[J]. 周维英,吴超,石云,邹全明.  中国人兽共患病学报. 2008(01)
[10]猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3基因的表达及其单克隆抗体的制备[J]. 刘金霞,周艳君,安同庆,仇华吉,王云峰,童光志.  中国兽医学报. 2007(05)

硕士论文
[1]PRRSV GP3和GP4的免疫活性及其在感染细胞内的分布研究[D]. 王中明.河南农业大学 2009
[2]猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5、M和N蛋白单克隆抗体的研制及生物学特性分析[D]. 马苏.南京农业大学 2006



本文编号：3516719