鸡氨肽酶N蛋白亲和肽的筛选与生物学活性鉴定
发布时间：2021-11-25 21:01
病毒受体是指存在于宿主细胞表面的,能够被病毒的吸附性蛋白识别并且与之结合,进而引起病毒感染动物的分子复合物。氨肽酶N（APN）是位于细胞表面的一种锌离子依赖的金属糖蛋向,是大多数Ⅰ型和Ⅱ型冠状病毒发生感染时的细胞受体。鸡传染性支气管炎病毒（IBV）属于Ⅲ型冠状病毒中的一种禽类冠状病毒,在进化上被认为是处于Ⅰ型和Ⅱ刑冠状病毒之间,目前IBV发生感染时的功能性细胞受体还没有完全被确定,在IBV的功能性细胞受体研究中,鸡氨肽酶N的研究最为广泛,目前IBV侵染的宿主大多限于禽类,因此更详细深入的探讨禽类APN是否是IBV感染的功能性受体是非常具有研究价值的。本实验从18日龄鸡的肾脏中提取了其总RNA,利用设计的分段引物采用RT-PCR方法对gAPN基因进行了分段克隆,然后利用SOE-PCR将各个片段连接构成了大小为2906bp的gAPN全长基因,将全长基因连接到原核表达载体pET30a （+）中构建原核表达质粒pET-gAPN,将其转化到E.Coli Rosetta中,诱导得到了大小为113kDa的重组蛋白,以重组蛋白pET-gAPN免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,间接ELISA检测多抗血清的...
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
CONTENTS
摘要
Abstract
1 引言
1.1 冠状病毒受体的研究进展
1.2 IBV感染细胞相关受体的研究进展
1.2.1 氨肽酶N(APN)
1.2.2 硫酸乙酰肝素
1.2.3 唾液酸
1.3 噬菌体展示技术研究进展
1.3.1 噬菌体展示技术的基本原理
1.3.2 噬菌体展示系统的分类
1.3.3 噬菌体展示技术的应用
1.4 研究目的与意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 菌种、载体及主要相关试剂
2.1.3 实验常规试剂的配制
2.1.4 仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 鸡氨肽酶N基因的克隆
2.2.2 gAPN原核及真核表达载体的构建及原核重组蛋白的诱导表达
2.2.3 gAPN重组蛋白的纯化及复性
2.2.4 多克隆抗血清的制备
2.2.5 多克隆抗血清的鉴定
2.2.6 噬菌体随机十二肽库对gAPN蛋白亲和配体的生物淘选
2.2.7 结合克隆的特征鉴定
2.2.8 亲和噬菌体共有氨基酸序列的推导及合成
2.2.9 亲和肽的生物活性鉴定
2.2.10 亲和噬菌体体内抗病毒活性
2.3 数据处理
3 结果
3.1 gAPN基因的克隆
3.2 gAPN基因序列测定与分析
3.3 鸡APN基因的重组原核、真核表达质粒的构建、蛋白表达
3.3.1 重组质粒的构建
3.3.2 原核重组蛋白的表达
3.3.3 原核重组蛋白的纯化
3.4 多克隆抗体的制备及鉴定
3.4.1 gAPN多克隆抗血清的效价测定
3.4.2 多克隆抗体的Western blot检测
3.4.3 多克隆抗体的IFA检测
3.5 噬菌体十二肽库对gAPN重组蛋白亲和配体的生物淘选
3.5.1 噬菌体十二肽库对gAPN重组蛋白的四轮淘洗
3.5.2 亲和多肽的生物活性检测
3.5.3 亲和噬菌体体内抗病毒活性
4 讨论
4.1 gAPN基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
4.2 重组蛋白的纯化及生物活性的恢复
4.3 多克隆抗体的制备及其活性检测
4.4 鸡氨肽酶N亲和肽的筛选与鉴定
4.5 亲和噬菌体体内抗病毒分析
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸡氨肽酶N基因转染BHK-21细胞后IBV感染情况的改变[J]. 明晓波,张颖,刘澜澜,魏萍. 中国兽医学报. 2010(06)
[2]鸡传染性支气管炎病毒受体研究进展[J]. 明晓波,魏萍. 动物医学进展. 2008(03)
[3]鲮生长激素的重组表达及其多克隆抗体的制备[J]. 姜巨峰,张殿昌,苏天凤,熊小飞,江世贵. 南方水产. 2008(01)
[4]冠状病毒概述[J]. 李金萍. 生命科学仪器. 2007(01)
[5]异种血管内皮生长因子基因重组T7噬菌体疫苗对小鼠Lewis肺癌的抑制作用[J]. 李晓慧,唐亮,刘岽,孙红梅,周彩存,谈立松,王丽萍,张培德,张尚权. 癌症. 2006(10)
[6]以金属蛋白酶APN/CD13为靶点的抗癌药物的化学生物学研究[J]. 张涛,徐文方. 中国药物与临床. 2004(09)
[7]丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5抗原模拟表位的筛选和鉴定[J]. 钟彦伟,成军,王刚,田小军,陈新华,刘妍,李莉,张玲霞,陈菊梅. 中华肝脏病杂志. 2002(04)
[8]新型噬菌体表面呈现载体的构建[J]. 刘志刚,俞炜源,林建波. 生物技术通讯. 2002(01)
[9]工程抗体的体外成熟[J]. 刘志刚,俞炜源. 生物技术通讯. 2002(01)
[10]噬菌体展示外源多肽的免疫原性研究[J]. 王桂云,朱筱娟,王丽. 东北师大学报(自然科学版). 2001(03)
博士论文
[1]鸡传染性支气管炎病毒感染HeLa细胞的研究及其天然受体的鉴定[D]. 陈汉阳.华中农业大学 2007
硕士论文
[1]鸡APN组织定量、表达及其作为IBV受体可能性评价[D]. 明晓波.东北农业大学 2009
本文编号：3518792
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
CONTENTS
摘要
Abstract
1 引言
1.1 冠状病毒受体的研究进展
1.2 IBV感染细胞相关受体的研究进展
1.2.1 氨肽酶N(APN)
1.2.2 硫酸乙酰肝素
1.2.3 唾液酸
1.3 噬菌体展示技术研究进展
1.3.1 噬菌体展示技术的基本原理
1.3.2 噬菌体展示系统的分类
1.3.3 噬菌体展示技术的应用
1.4 研究目的与意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 菌种、载体及主要相关试剂
2.1.3 实验常规试剂的配制
2.1.4 仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 鸡氨肽酶N基因的克隆
2.2.2 gAPN原核及真核表达载体的构建及原核重组蛋白的诱导表达
2.2.3 gAPN重组蛋白的纯化及复性
2.2.4 多克隆抗血清的制备
2.2.5 多克隆抗血清的鉴定
2.2.6 噬菌体随机十二肽库对gAPN蛋白亲和配体的生物淘选
2.2.7 结合克隆的特征鉴定
2.2.8 亲和噬菌体共有氨基酸序列的推导及合成
2.2.9 亲和肽的生物活性鉴定
2.2.10 亲和噬菌体体内抗病毒活性
2.3 数据处理
3 结果
3.1 gAPN基因的克隆
3.2 gAPN基因序列测定与分析
3.3 鸡APN基因的重组原核、真核表达质粒的构建、蛋白表达
3.3.1 重组质粒的构建
3.3.2 原核重组蛋白的表达
3.3.3 原核重组蛋白的纯化
3.4 多克隆抗体的制备及鉴定
3.4.1 gAPN多克隆抗血清的效价测定
3.4.2 多克隆抗体的Western blot检测
3.4.3 多克隆抗体的IFA检测
3.5 噬菌体十二肽库对gAPN重组蛋白亲和配体的生物淘选
3.5.1 噬菌体十二肽库对gAPN重组蛋白的四轮淘洗
3.5.2 亲和多肽的生物活性检测
3.5.3 亲和噬菌体体内抗病毒活性
4 讨论
4.1 gAPN基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
4.2 重组蛋白的纯化及生物活性的恢复
4.3 多克隆抗体的制备及其活性检测
4.4 鸡氨肽酶N亲和肽的筛选与鉴定
4.5 亲和噬菌体体内抗病毒分析
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸡氨肽酶N基因转染BHK-21细胞后IBV感染情况的改变[J]. 明晓波,张颖,刘澜澜,魏萍. 中国兽医学报. 2010(06)
[2]鸡传染性支气管炎病毒受体研究进展[J]. 明晓波,魏萍. 动物医学进展. 2008(03)
[3]鲮生长激素的重组表达及其多克隆抗体的制备[J]. 姜巨峰,张殿昌,苏天凤,熊小飞,江世贵. 南方水产. 2008(01)
[4]冠状病毒概述[J]. 李金萍. 生命科学仪器. 2007(01)
[5]异种血管内皮生长因子基因重组T7噬菌体疫苗对小鼠Lewis肺癌的抑制作用[J]. 李晓慧,唐亮,刘岽,孙红梅,周彩存,谈立松,王丽萍,张培德,张尚权. 癌症. 2006(10)
[6]以金属蛋白酶APN/CD13为靶点的抗癌药物的化学生物学研究[J]. 张涛,徐文方. 中国药物与临床. 2004(09)
[7]丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5抗原模拟表位的筛选和鉴定[J]. 钟彦伟,成军,王刚,田小军,陈新华,刘妍,李莉,张玲霞,陈菊梅. 中华肝脏病杂志. 2002(04)
[8]新型噬菌体表面呈现载体的构建[J]. 刘志刚,俞炜源,林建波. 生物技术通讯. 2002(01)
[9]工程抗体的体外成熟[J]. 刘志刚,俞炜源. 生物技术通讯. 2002(01)
[10]噬菌体展示外源多肽的免疫原性研究[J]. 王桂云,朱筱娟,王丽. 东北师大学报(自然科学版). 2001(03)
博士论文
[1]鸡传染性支气管炎病毒感染HeLa细胞的研究及其天然受体的鉴定[D]. 陈汉阳.华中农业大学 2007
硕士论文
[1]鸡APN组织定量、表达及其作为IBV受体可能性评价[D]. 明晓波.东北农业大学 2009
本文编号：3518792
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