O抗原重组减毒沙门菌对O 1 、O 2 和O 78 禽致病性大肠杆菌的免疫保护研究
发布时间：2021-11-27 07:21
禽致病性大肠杆菌（APEC）O1、O2和O78是许多地区田间感染中分离率最高的血清型。已知针对O抗原多糖的特异性免疫应答可以对APEC提供免疫保护,目前尚无有效的通过O抗原多糖来预防APEC感染的疫苗。因此本研究的主要目的是通过构建O抗原重组减毒沙门菌以提供对APEC三种血清型的免疫保护。主要内容和结果如下:1.组装O抗原多糖的酵母-原核穿梭质粒的构建使用PCR扩增含有酵母复制及筛选元件的片段ARS4/CEN5-TRP-Spec和原核复制及筛选元件的片段ori-asd-T1T2,在Gibson重组酶作用下实现重组,获得用于组装DNA长片段的、含有不同原核复制起点的酵母-原核穿梭质粒pSS25、pSS26、pG8R210和pG8R211。2.编码APEC O1、O2和O78的O抗原基因簇组装将大小分别为10.9 kb、15.9 kb、13.2 kb、26.9 kb、29.1 kb和40.1 kb的APEC O1、O2
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：123 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
穿梭质粒构建流程图及质粒图谱
图 2-1 穿梭质粒构建流程图及质粒图谱。A 为 TRP1-ARS4/CEN5-Spec 片段。B 为含有不同复制起点的 T1T2-ori-asd 片段。C 为含有 pSC101和 p15a 复制起点的穿梭质粒图谱。D 为含有 pBR 和 pUC 复制起点的穿梭质粒图谱[46]。Fig. 2-1 Construction and plasmids map of pG8R210/ pG8R211 and pSS25/pSS26.A is the fragment of TRP1-ARS4/CEN5-Spec. B is the fragment of T1T2-ori-asd. C is the plasmid map ofpSS25/pSS26. D is the plasmid map of pG8R210/pG8R211[46].3.2 重组质粒 PCR 鉴定使用引物 V-F1/R1、V-F2/R2 对构建的质粒进行 PCR 鉴定。结果表明含有重组质粒pG8R210、pG8R211、pSS25 和 pSS26 的阳性菌落均能扩增出大小为 579 bp 和 695 bp 的片段，与预期大小相同（图 2-2A）。其次，分别使用引物 V-F3/R3、V-F4/R3 对重组质粒 pSS25 和 pSS26 的 Cen-Trp 原件进行扩增，结果显示 PCR 扩增出大小分别为 1340 bp 和 675 bp 的片段（图 2-2B、C），表明在原核细胞中复制的重组质粒也具有酵母复制原件，提示穿梭质粒构建成功。
转移细胞悬液至 1.5 mL 离心管中，高速离心 15 s，弃上清，600 μL 1 ×TE/LiA重悬沉淀，冻存备用。2.4.2 酵母转化介导的同源重组(TAR)将待组装的 DNA 片段（100-200 ng）、线性化质粒 pYES1L（100-200 ng）与变性鲑精DNA混合后加入解冻的Mav203感受态细胞中，DNA混合液总体积需小于等于（ 10 μL，轻击混匀各组分后，加入 500 μL 解冻的 PEG/LiAc 溶液，上下翻转 5-8 次充分匀后于30°C水浴30 min，期间间隔10 min翻转一次以混匀各组分。然后加入20 μLDMS上下翻转 5-8 次混合，42°C 热激 20 min，期间上下翻转充分混合各组分。最后，1800 rp离心 5 min，小心去掉上清，使用 1 mL 灭菌的 0.9% NaCl 重悬，轻轻吹打，从中取 100 μ涂布于 SD-Trp 平板上，30°C 培养三天，PCR 鉴定。参照图 3-1 所示的方法将截段的 APEC O1、O2和 O78O 抗原基因簇通过 TAR 法组至穿梭质粒 pSS26 中。获得含有 O 抗原基因簇的重组质粒 pSS27、pSS28、pG8R206pG8R207、pG8R208 和 pG8R209 等。
【参考文献】：
期刊论文
[1]病原细菌多糖疫苗和多糖结合疫苗研究进展[J]. 潘超,朱力,王恒樑. 生物技术通讯. 2013(05)
[2]规模化鸭场鸭源致病性沙门氏菌的药物敏感性检测及耐药性分析[J]. 钟传德,程安春,汪铭书,李玲,段泽,于小娜,仲崇岳,陈孝跃. 中国兽医杂志. 2008(01)
[3]鸭源致病性大肠杆菌的血清型鉴定及其相关毒力基因分析[J]. 于学辉,程安春,汪铭书,王英,王远微,汤承. 畜牧兽医学报. 2008(01)
[4]雏鸭致病性大肠杆菌的分离鉴定药敏试验及耐药性分析[J]. 李玲,汪铭书,程安春,于小娜,钟传德,段泽,陈孝跃. 中国兽医杂志. 2007(12)
[5]鸭源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA基因的原核表达及重组蛋白对强毒攻击的免疫保护作用[J]. 程安春,于小娜,汪铭书,朱德康,李玲,孙磊,陈孝跃. 生物工程学报. 2007(03)
[6]种鸭大肠杆茵性生殖器官病的研究——6.氢氧化铝甲醛灭活菌苗免疫原性的研究[J]. 程安春,李玉华. 四川农业大学学报. 1990(03)
本文编号：3521806
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：123 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
穿梭质粒构建流程图及质粒图谱
图 2-1 穿梭质粒构建流程图及质粒图谱。A 为 TRP1-ARS4/CEN5-Spec 片段。B 为含有不同复制起点的 T1T2-ori-asd 片段。C 为含有 pSC101和 p15a 复制起点的穿梭质粒图谱。D 为含有 pBR 和 pUC 复制起点的穿梭质粒图谱[46]。Fig. 2-1 Construction and plasmids map of pG8R210/ pG8R211 and pSS25/pSS26.A is the fragment of TRP1-ARS4/CEN5-Spec. B is the fragment of T1T2-ori-asd. C is the plasmid map ofpSS25/pSS26. D is the plasmid map of pG8R210/pG8R211[46].3.2 重组质粒 PCR 鉴定使用引物 V-F1/R1、V-F2/R2 对构建的质粒进行 PCR 鉴定。结果表明含有重组质粒pG8R210、pG8R211、pSS25 和 pSS26 的阳性菌落均能扩增出大小为 579 bp 和 695 bp 的片段，与预期大小相同（图 2-2A）。其次，分别使用引物 V-F3/R3、V-F4/R3 对重组质粒 pSS25 和 pSS26 的 Cen-Trp 原件进行扩增，结果显示 PCR 扩增出大小分别为 1340 bp 和 675 bp 的片段（图 2-2B、C），表明在原核细胞中复制的重组质粒也具有酵母复制原件，提示穿梭质粒构建成功。
转移细胞悬液至 1.5 mL 离心管中，高速离心 15 s，弃上清，600 μL 1 ×TE/LiA重悬沉淀，冻存备用。2.4.2 酵母转化介导的同源重组(TAR)将待组装的 DNA 片段（100-200 ng）、线性化质粒 pYES1L（100-200 ng）与变性鲑精DNA混合后加入解冻的Mav203感受态细胞中，DNA混合液总体积需小于等于（ 10 μL，轻击混匀各组分后，加入 500 μL 解冻的 PEG/LiAc 溶液，上下翻转 5-8 次充分匀后于30°C水浴30 min，期间间隔10 min翻转一次以混匀各组分。然后加入20 μLDMS上下翻转 5-8 次混合，42°C 热激 20 min，期间上下翻转充分混合各组分。最后，1800 rp离心 5 min，小心去掉上清，使用 1 mL 灭菌的 0.9% NaCl 重悬，轻轻吹打，从中取 100 μ涂布于 SD-Trp 平板上，30°C 培养三天，PCR 鉴定。参照图 3-1 所示的方法将截段的 APEC O1、O2和 O78O 抗原基因簇通过 TAR 法组至穿梭质粒 pSS26 中。获得含有 O 抗原基因簇的重组质粒 pSS27、pSS28、pG8R206pG8R207、pG8R208 和 pG8R209 等。
【参考文献】：
期刊论文
[1]病原细菌多糖疫苗和多糖结合疫苗研究进展[J]. 潘超,朱力,王恒樑. 生物技术通讯. 2013(05)
[2]规模化鸭场鸭源致病性沙门氏菌的药物敏感性检测及耐药性分析[J]. 钟传德,程安春,汪铭书,李玲,段泽,于小娜,仲崇岳,陈孝跃. 中国兽医杂志. 2008(01)
[3]鸭源致病性大肠杆菌的血清型鉴定及其相关毒力基因分析[J]. 于学辉,程安春,汪铭书,王英,王远微,汤承. 畜牧兽医学报. 2008(01)
[4]雏鸭致病性大肠杆菌的分离鉴定药敏试验及耐药性分析[J]. 李玲,汪铭书,程安春,于小娜,钟传德,段泽,陈孝跃. 中国兽医杂志. 2007(12)
[5]鸭源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA基因的原核表达及重组蛋白对强毒攻击的免疫保护作用[J]. 程安春,于小娜,汪铭书,朱德康,李玲,孙磊,陈孝跃. 生物工程学报. 2007(03)
[6]种鸭大肠杆茵性生殖器官病的研究——6.氢氧化铝甲醛灭活菌苗免疫原性的研究[J]. 程安春,李玉华. 四川农业大学学报. 1990(03)
本文编号：3521806
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