维氏气单胞菌脂蛋白Lpp基因缺失株的构建及其部分生物学特性分析

发布时间：2021-11-27 13:14

　　为了探究维氏气单胞菌毒力因子脂蛋白的致病机制,在全基因测序的基础上,通过同源重组缺失脂蛋白基因。首先扩增脂蛋白基因的上下游同源臂,通过重叠PCR连接后,凝胶回收DNA片段;连接克隆载体pMD18-T,转化DH5α感受态细胞,测序成功后提取质粒进行双酶切,连入相同酶切的Pre112自杀性质粒;依次转化DH5α-λpir、WM3064感受态细胞,作为供体菌;和受体菌野生株进行同源重组,并筛选鉴定。结果显示,成功缺失了维氏气单胞菌脂蛋白基因。生物学特性分析结果发现,缺失株和野生株的生长速度相似,生物膜形成能力降低,鞭毛缺失,游动能力减弱,细菌的毒力降低,溶血活性没有明显变化。因此,成功构建了维氏气单胞菌脂蛋白基因缺失株,并分析了其部分生物学特性,为进一步研究脂蛋白基因的功能奠定了一定的基础。 

【文章来源】：中国兽医科学. 2020,50(11)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

上下游同源臂的扩增连接与重组质粒的酶切鉴定

取结合转移中第2次同源重组的菌液提取基因组，用引物L-1-F和L-2-R验证，在996 bp处可见特异性条带（见图2A），表明缺失株构建成功。对缺失成功的菌株进行c DNA验证，首先对提取的RNA进行质量和完整性检测，有3条清晰条带，RNA完整（见图2B）。反转录得到c DNA后作为模板进行PCR验证，只有WT有238 bp的条带，其他没有条带（见图2C），证明已成功构建了脂蛋白Lpp缺失株ΔLpp。对验证成功的ΔLpp进行遗传稳定性的检测，取缺失株传代第43～50次的菌液进行PCR验证，在996 bp处均有条带，表明遗传稳定（见图2D）。2.2 脂蛋白Lpp基因的表达情况

以16S r RNA为内参基因进行实时荧光定量PCR检测，WT作为对照，结果未检测到缺失株中Lpp基因的表达（见图3）。2.3 缺失株ΔLpp的生物学特性分析

【参考文献】：
期刊论文
[1]维氏气单胞菌rpoN基因缺失株的构建及部分生物学特性分析[J]. 蔡金双,王冬雪,单晓枫,康元环,张冬星,田佳鑫.  中国兽医科学. 2020(06)



本文编号：3522362