单增李斯特菌感染依赖溶血素LLO触发ERK1/2磷酸化机制研究
发布时间：2021-11-28 11:30
单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）是一种革兰氏阳性胞内菌。该菌含有溶血素O（Listeriolysin O,LLO）,可引起宿主细胞膜结构穿孔,对于单增李斯特菌在细胞内复制至关重要。前期有研究发现,单增李斯特菌感染宿主细胞后,LLO能引起丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族蛋白ERK1/2磷酸化,但机制未知。本研究以单增李斯特菌感染Caco-2细胞为模型解析ERK1/2被磷酸化的分子机制。我们分别利用单增李斯特菌和纯化的重组LLO蛋白（5n M）感染或处理Caco-2细胞,检测ERK1/2的表达及磷酸化水平变化。我们发现,单增李斯特菌感染Caco-2细胞后能显著增加ERK1/2的磷酸化水平,并在感染或处理半个小时后达到高峰且呈LLO依赖性。该ERK1/2的磷酸化水平与细胞内LLO的浓度呈正相关,当用胆固醇封闭LLO对宿主细胞的膜结合位点后,LLO丧失启动ERK1/2磷酸化的能力。我们也发现,LLO缺失活性位点PEST序列并不影响其激活ERK1/2磷酸化,这说明LLO启动ERK1/2的磷酸化与LLO与宿主细胞的膜结合位点有关而与活性位点无关。进一步...
【文章来源】：浙江农林大学浙江省
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
单增李斯特菌野生型菌株EGD-e（A）或hly缺失和回补突变体（B）在所示时间点感染Caco-2激活MAPK的磷酸化ERK1/2蛋白表达情况
试验研究152.2重组蛋白LLO处理Caco-2细胞活化ERK1/2蛋白分析Caco-2细胞与5nM浓度的LLO一起孵育，如图1.2A所示，孵育5分钟便显示出明显的ERK1/2磷酸化的活化，这种情况在一小时后逐渐消失，我们推测这种情况与LLO胞内降解有关。我们还发现ERK1/2磷酸化的激活作用呈LLO浓度依赖性，0.5nM的非常低的浓度足以激活ERK1/2磷酸化，ERK1/2磷酸化蛋白也随着LLO浓度的递增而逐渐增多，见图1.2B。图1.1.单增李斯特菌野生型菌株EGD-e（A）或hly缺失和回补突变体（B）在所示时间点感染Caco-2激活MAPK的磷酸化ERK1/2蛋白表达情况。*P<0.05;**P<0.01;ns，无显著差异。Figure1.1.ExpressionofMAPkinasesERK1andERK2inhumanepithelialcellsCaco-2infectedwithLMwild-typeEGD-e(A)orthehlydeletionandcomplementedmutants(B)fortheindicatedtimepoints.P<0.05;P<0.01;nsmeansnosignificance.图1.2.纯化的重组LLO蛋白在不同时间点（A）和不同浓度（B）处理Caco-2细胞激活磷酸化ERK1/2蛋白表达情况。*P<0.05;**P<0.01;ns，无显著差异。Figure1.2.ExpressionofERK1/2inCaco-2cellstreatedwiththepurifiedrecombinantLLOatdifferenttimepoints(A)withvariousconcentrationsofprotein(B).P<0.05;P<0.01;nsmeansnosignificance.
试验研究252试验结果2.1PEST序列不影响LLO激活ERK1/2磷酸化用1％TritonX-100孵育的红细胞确定最大（100％）溶血活性，用PBS孵育的红细胞确定最小（0％）溶血活性。纯化的LLO或其变蛋白LLOΔPEST在各种浓度（0-35nM）下的溶血情况见图2.1A，PEST序列在一定浓度下不影响LLO的溶血活性。并且，当我们使用LLO能引起细胞发生磷酸化的孵育浓度5nM时，PEST序列在LLO诱导Caco-2细胞中的ERK1/2蛋白磷酸化中并未起到关键作用，详见图2.1B。2.2LLO对细胞膜的裂解能力与其含量成正比鉴于LLO最主要的功能是锚定富含胆固醇的细胞膜，并进行打孔，这里利用碘化丙碇检测了LLO不同浓度下对细胞的膜的破坏情况，见图2.2。LLO在低至0.5nM的浓度下基本无法直观观察到其对细胞膜的作用，但随着LLO蛋白图2.1.PEST序列对LLO激活ERK1/2磷酸化的影响。（A）纯化的LLO或其变体LLOΔPEST在各种浓度（0-35nM）下的溶血活性。用1%TritonX-100或PBS孵育的红细胞分别用于确定最大（100％）和最小（0％）溶血活性。（B）LLOPEST样序列在Caco-2细胞中诱导的ERK1/2磷酸化的作用及灰度分析。*P<0.05;**P<0.01;ns，无显著差异。Figure2.1.TheinfluenceofPESTsequenceonLLOactivationofERK1/2phosphorylation.(A)HemolyticactivityofthepurifiedLLOoritsvariantLLOΔPESTatvariousconcentrations(0-35nM).Erythrocytesincubatedwith1%TritonX-100orPBSservedtodeterminethemaximum(100%)andminimum(0%)hemolyticactivity,respectively.(B)RolesofthePEST-likesequenceinLLO-inducedERK1/2phosphorylationinCaco-2cells.P<0.05;P<0.01;nsmeansnosignificance.
本文编号：3524344
【文章来源】：浙江农林大学浙江省
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
单增李斯特菌野生型菌株EGD-e（A）或hly缺失和回补突变体（B）在所示时间点感染Caco-2激活MAPK的磷酸化ERK1/2蛋白表达情况
试验研究152.2重组蛋白LLO处理Caco-2细胞活化ERK1/2蛋白分析Caco-2细胞与5nM浓度的LLO一起孵育，如图1.2A所示，孵育5分钟便显示出明显的ERK1/2磷酸化的活化，这种情况在一小时后逐渐消失，我们推测这种情况与LLO胞内降解有关。我们还发现ERK1/2磷酸化的激活作用呈LLO浓度依赖性，0.5nM的非常低的浓度足以激活ERK1/2磷酸化，ERK1/2磷酸化蛋白也随着LLO浓度的递增而逐渐增多，见图1.2B。图1.1.单增李斯特菌野生型菌株EGD-e（A）或hly缺失和回补突变体（B）在所示时间点感染Caco-2激活MAPK的磷酸化ERK1/2蛋白表达情况。*P<0.05;**P<0.01;ns，无显著差异。Figure1.1.ExpressionofMAPkinasesERK1andERK2inhumanepithelialcellsCaco-2infectedwithLMwild-typeEGD-e(A)orthehlydeletionandcomplementedmutants(B)fortheindicatedtimepoints.P<0.05;P<0.01;nsmeansnosignificance.图1.2.纯化的重组LLO蛋白在不同时间点（A）和不同浓度（B）处理Caco-2细胞激活磷酸化ERK1/2蛋白表达情况。*P<0.05;**P<0.01;ns，无显著差异。Figure1.2.ExpressionofERK1/2inCaco-2cellstreatedwiththepurifiedrecombinantLLOatdifferenttimepoints(A)withvariousconcentrationsofprotein(B).P<0.05;P<0.01;nsmeansnosignificance.
试验研究252试验结果2.1PEST序列不影响LLO激活ERK1/2磷酸化用1％TritonX-100孵育的红细胞确定最大（100％）溶血活性，用PBS孵育的红细胞确定最小（0％）溶血活性。纯化的LLO或其变蛋白LLOΔPEST在各种浓度（0-35nM）下的溶血情况见图2.1A，PEST序列在一定浓度下不影响LLO的溶血活性。并且，当我们使用LLO能引起细胞发生磷酸化的孵育浓度5nM时，PEST序列在LLO诱导Caco-2细胞中的ERK1/2蛋白磷酸化中并未起到关键作用，详见图2.1B。2.2LLO对细胞膜的裂解能力与其含量成正比鉴于LLO最主要的功能是锚定富含胆固醇的细胞膜，并进行打孔，这里利用碘化丙碇检测了LLO不同浓度下对细胞的膜的破坏情况，见图2.2。LLO在低至0.5nM的浓度下基本无法直观观察到其对细胞膜的作用，但随着LLO蛋白图2.1.PEST序列对LLO激活ERK1/2磷酸化的影响。（A）纯化的LLO或其变体LLOΔPEST在各种浓度（0-35nM）下的溶血活性。用1%TritonX-100或PBS孵育的红细胞分别用于确定最大（100％）和最小（0％）溶血活性。（B）LLOPEST样序列在Caco-2细胞中诱导的ERK1/2磷酸化的作用及灰度分析。*P<0.05;**P<0.01;ns，无显著差异。Figure2.1.TheinfluenceofPESTsequenceonLLOactivationofERK1/2phosphorylation.(A)HemolyticactivityofthepurifiedLLOoritsvariantLLOΔPESTatvariousconcentrations(0-35nM).Erythrocytesincubatedwith1%TritonX-100orPBSservedtodeterminethemaximum(100%)andminimum(0%)hemolyticactivity,respectively.(B)RolesofthePEST-likesequenceinLLO-inducedERK1/2phosphorylationinCaco-2cells.P<0.05;P<0.01;nsmeansnosignificance.
本文编号：3524344
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3524344.html
