猪胰腺脂肪酶密码子重组优化、毕赤酵母高效表达及酶学特性分析

发布时间：2021-12-09 14:19

　　猪胰腺脂肪酶（PPL）是一种由449个氨基酸组成的单链球蛋白,分子大小在50-52kDa。猪胰腺脂肪酶作为一种内源性的脂肪酶,能高效的将甘油三酯水解并释放脂肪酸。在动物机体内,饲粮中脂肪的消化吸收主要依赖于胰腺酶类。脂肪的消化对动物特别对能量要求极高的仔猪具有重要意义,因为仔猪从饲粮中获得的能量有时不能满足自身的需求,需要动用机体沉积的脂肪来满足能量需求。在仔猪断奶期间,胰腺消化酶的激活、分泌和功能尚未发育完善,特别是一些主要分解类的酶如脂肪酶。在幼龄阶段尤其是断奶期间,PPL分泌不足会导致仔猪应激,造成生长停顿或迟缓,造成重大的经济损失。商品的猪胰腺脂肪酶常用于帮助患有胰腺功能紊乱和营养不良的病人,帮助病人消化。但是商品猪胰腺脂肪酶主要来源于动物胰腺提取,在提取过程中会有一些其他酶类的污染。在生产过程中酶蛋白的提取和纯化的高成本、猪胰腺组织资源有限、潜在的微生物疾病污染等因素限制了猪胰腺脂肪酶在饲料工业中的大规模生产应用。因此,有必要开发一种利用基因工程重组技术在酵母表达系统中高效、安全表达具有天然生物学活性猪胰腺脂肪酶的方法。本研究的目的是通过对猪胰腺脂肪酶（PPL）部分基因进行密... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
中英文缩写词表
前言
1 文献综述
    1.1 脂肪酶研究概况
        1.1.1 脂肪酶的来源与分布
        1.1.2 脂肪酶的结构和生物学特点
        1.1.3 脂肪酶的研究进展
        1.1.4 脂肪酶在生产中的应用
    1.2 胰腺脂肪酶研究进展
        1.2.1 胰腺脂肪酶的结构
        1.2.2 胰腺脂肪酶的功能
        1.2.3 影响胰腺脂肪酶活性的因素
    1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统研究概况
        1.3.1 巴斯德毕赤酵母表达系统宿主菌
        1.3.2 毕赤酵母的表达载体
        1.3.3 外源基因在毕赤酵母中的表达
        1.3.4 巴斯德毕赤酵母表达系统的优化
2 本研究的意义、研究目标以及技术路线
    2.1 本研究的意义
    2.2 本研究的研究目标
    2.3 本研究技术路线
3 材料与方法
    3.1 材料与仪器
        3.1.1 菌株及试剂
        3.1.2 试验主要仪器设备
        3.1.3 试验培养基
        3.1.4 相关溶液的配置
        3.1.5 引物设计
    3.2 实验方法
        3.2.1 PPL的改造
        3.2.2 表达载体pPICZaA-rePPL的构建
        3.2.3 pPICZaA-rePPL在毕赤酵母中的表达与纯化
        3.2.4 对转化子进行Real-Time PCR筛选
        3.2.5 用甲醇诱导重组rePPL的表达及纯化
        3.2.6 重组rePPL的分子量及浓度测定
        3.2.7 rePPL活性检测
        3.2.8 酶的最适反应温度
        3.2.9 酶的最适pH
        3.2.10 酶的热稳定性
        3.2.11 酶的Km值和Vmax的测定
        3.2.12 金属离子对酶活力的影响
4 实验结果与分析
    4.1 PPL基因的改造
    4.2 重组表达载体pPICZaA-rePPL的构建
    4.3 毕赤酵母中的pPICZaA-rePPL表达菌体的转化与筛选
    4.4 rePPL在巴斯德毕赤酵母中的表达以及纯化
    4.5 纯化重组蛋白的浓度测定
    4.6 重组脂肪酶的酶学性质分析
5 讨论
    5.1 脂肪酶在毕赤酵母中的表达
    5.2 有关脂肪酶活力的测定
    5.3 有关脂肪酶的酶学性质
6 结论与展望
    6.1 研究结论
    6.2 展望
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]脂肪酶活力测定方法及其在筛选产脂肪酶微生物中的应用[J]. 王欢,何腊平,周换景,张义明,李翠芹,陶菡.  生物技术通报. 2013(01)
[2]脂肪酶特性与应用[J]. 陈倩婷.  饲料研究. 2011(06)
[3]脂肪酶在畜禽养殖业中的应用与研究[J]. 杨滔,桂涛,李春梅,王有芳.  北方牧业. 2011(11)
[4]脂肪酶及其在饲料工业中的应用研究[J]. 杨滔,桂涛,李春梅,王有芳.  饲料工业. 2011(S1)
[5]黑曲霉脂肪酶盖子结构域突变对其活性的影响[J]. 薛龙吟,林瑞凤,舒正玉,黄建忠.  生物技术通报. 2010(02)
[6]P197E与ep8叠加突变对扩展青霉脂肪酶热稳定性的影响[J]. 刘燕雅,黄平,司圣乾,陈彦,林琳.  微生物学通报. 2010(02)
[7]定向进化-易错PCR方法提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力[J]. 王睿,喻晓蔚,沙冲,徐岩.  生物工程学报. 2009(12)
[8]定向进化提高枯草芽孢杆菌脂肪酶的活力[J]. 赵博,陶进,马吉胜,廉虹,王岩,常琳,高仁钧,曹淑桂.  催化学报. 2009(04)
[9]随机突变对扩展青霉脂肪酶最适作用温度的改善[J]. 胡长浩,邹有土,刘燕雅,冯蔚宗,林琳.  饲料工业. 2009(06)
[10]动物消化道脂肪酶研究概述[J]. 杨汉博,王峰.  饲料广角. 2009(05)

博士论文
[1]洋葱伯克霍尔德菌的筛选、鉴定及其脂肪酶基因的高效表达[D]. 贾彬.华中科技大学 2010
[2]黑曲霉脂肪酶的酶学性质、基因克隆与表达及结构预测[D]. 舒正玉.华中科技大学 2007
[3]荧光假单孢菌脂肪酶基因的克隆、改造及其在毕赤酵母中的表达[D]. 王海燕.中国农业科学院 2006

硕士论文
[1]脂肪酶等在造纸过程中的应用及机理研究[D]. 王洪振.山东轻工业学院 2011
[2]猪胰腺脂肪酶基因克隆、毕赤酵母表达及其酶活性检测[D]. 谢小莉.四川农业大学 2011
[3]来源于Selenomonas ruminantium的植酸酶基因的改造及在毕赤酵母中的高效表达[D]. 都占魁.中国农业科学院 2002



本文编号：3530785