猪流行性腹泻病毒影响感染细胞内调控NF-κB信号通路的lncRNA表达研究
发布时间：2021-12-11 10:19
猪流行性腹泻是一种由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的急性肠道传染病,主要引起一周龄内新生仔猪呈水样腹泻,伴随有呕吐,萎靡,食欲减退,常引发严重脱水而死亡,对畜牧业造成极大的损失。小肠的炎症反应是PEDV感染引起仔猪腹泻、脱水的主要原因,该反应主要通过激活NF-κB信号通路产生炎性细胞因子发挥作用。而NF-κB信号通路的调控既包括蛋白水平的信号分子表达量和翻译后修饰调控,也包括转录水平的mi RNA、lnc RNA等的表达和作用,但lnc RNA是否参与PEDV感染过程中炎症的调控尚未得知。本研究利用二代转录组测序技术,分析PEDV感染猪小肠以及Vero细胞样品中lnc RNA的表达水平,重点筛选与NF-κB通路相关并差异表达的lnc RNA,荧光定量PCR验证其表达规律,构建lnc RNA过表达载体,在Vero细胞中进行真核表达,分析过表达lnc RNA后PEDV复制水平的变化,初步分析lnc RNA在PEDV感染过程的影响机制,为猪流行性腹泻的致病机理研究提供一定基础。1、PEDV感染猪小肠样品以及Vero细胞样品的转录组分析本研究通过PEDV-YJH分别感染猪小肠组织以及Vero...
【文章来源】：浙江农林大学浙江省
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同胰酶浓度及病毒接种量下Vero细胞各时间段的CPE情况
PEDV感染细胞和猪小肠组织的转录组分析23virusinoculationTrypsinconcentration：A.2.5μg/mL；B.2.5μg/mL；C.5μg/mL；D.5μg/mLVirusinoculation：A.0.6MOI；B.1.2MOI；C.0.6MOI；D.1.2MOI2.2PEDV-YJH细胞感染试验及免疫组化结果实验所用PEDV毒株来源于浙江内规模化养殖场的临床腹泻样本，通过Vero细胞，分离出PEDV-YJH毒株，病毒传代条件为：病毒维持液是高糖DMEM中加入胰酶（不含EDTA）的浓度为5μg/mL；PEDV接种量为1.2MOI。传代至90代次后，测得病毒滴度为107TCID50/0.1mL。病毒接种Vero细胞后，20h开始出现少量CPE，48h出现大面积CPE，72h细胞基本全部裂解。如图所示，生长曲线显示PEDV-YJH在36h-72h达到对数生长期，免疫组化结果可看出小肠上皮细胞出现大面积凋亡情况。图2PEDV分离及生物学特征鉴定A.PEDV-YJH感染Vero细胞的CPE变化；B.PEDV-YJH的生长曲线；C.PEDV感染仔猪后肠道上皮细胞的组织病理变化。Figure2IsolationofPEDVandidentificationofbiologicalcharacteristicsA.CPEchangesofVerocellsinfectedwithPEDV-YJH;B.GrowthcurvesofPEDV-YJH;C.HistopathologicalchangesofintestinalepithelialcellsafterpigletsinfectedwithPEDV.2.3PEDV-YJH感染猪小肠组织LncRNA的表达谱分析PEDV-YJH（1×10-7TCID50/头）口服感染仔猪后，收集小肠样品进行二代转录组学测序。通过测序结果构建了mRNA差异表达谱和LncRNA差异表达谱，其中mRNA表达谱中有167条基因上调以及169条基因下调，LncRNA表达谱中则相对较少,共含有47条上调LncRNA和62条下调LncRNA。在差异表达的
PEDV感染细胞和猪小肠组织的转录组分析24lncRNA中选择9组与NF-κB信号通路相关联的，以这些lncRNA的靶向基因命名，分别为1.LncRNAMOCR1；2.LncRNAPKCE；3.LncRNACNOT1；4.LncRNAIFN-OMEGA；5.LncRNACDC42BPA；6.LncRNASUDS3；7.LncRNAPSMA5；8.LncRNAIL7；9.LncRNACACNA1E。括号中为转录组测序结果中与之相靶向的mRNA。使用预先设计好的引物进行实时荧光定量PCR验证。RT-PCR结果表明LncRNASUDS3与对照相比表达水平显著提高。图3仔猪小肠样品lncRNA差异表达谱A.PEDV感染仔猪后肠道组织LncRNA表达热点图；B.LncRNA的靶基因信号通路KEGG富集；C.病毒感染后mRNA以及LncRNA表达差异统计；D.荧光定量PCR验证LncRNA表达差异结果Figure3DifferentialexpressionoflncRNAinpigletsmallintestinesamplesA.HotspotsofLncRNAexpressioninintestinaltissuesafterPEDVinfectioninpiglets;B.KEGGenrichmentofLncRNAtargetgenesignalingpathway;C.StatisticsofmRNAandLncRNAexpressiondifferencesafterviralinfection;D.ResultsofLncRNAexpressiondifferencesverifiedbyfluorescencequantitativePCR2.4PEDV-YJH感染Vero细胞lncRNA表达差异分析用Vero细胞进行铺板，分成对照组和实验组，每组都设置0h、24h、48h三个时间点，每个时间点设置三个重复，进行转录组测序分析。我们发现不同时
【参考文献】：
期刊论文
[1]肺结核患者外周血单个核细胞NFκB1与LncRNA-PACER的表达关系研究[J]. 黄东轩,何朝文,廖毅力,彭剑锋,杨帆,曹亚辉,黄冬生. 海南医学院学报. 2020(04)
[2]中药阻断NF-κB信号通路抑制Ⅰ型单纯疱疹病毒感染的研究进展[J]. 綦鲁博,张保平. 中国医药导报. 2020(01)
[3]过表达SIRT1抑制脂多糖诱导的胰岛β细胞炎症因子表达及NF-κB信号通路激活[J]. 简磊,胡斌,高明杰. 免疫学杂志. 2019(08)
[4]与猪流行性腹泻病毒M蛋白互作的宿主蛋白的鉴定[J]. 王瑞阳,于瑞嵩,陈冰清,李凤平,谢春芳,司伏生,董世娟,李震. 微生物学通报. 2019(06)
[5]羊口疮病毒ORF128锚蛋白对HEK293T细胞NF-κB信号通路的调节作用及机制[J]. 安雪珂,贾怀杰,冯园,陈国华,何小兵,景志忠,王晓霞. 细胞与分子免疫学杂志. 2019(03)
[6]PEDV M蛋白对Ⅰ型干扰素信号通路的抑制作用[J]. 陈盼,李莎莎,朱紫祥,郑海学,徐志文. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2019(07)
[7]基于PEDV M基因RT-LAMP快速检测方法的建立与应用[J]. 陈希文,尹苗,汪谦,杨勤,杨凤,李莲,罗文涛,周杰珑,马缨,赵洪. 中国兽医学报. 2018(09)
[8]猪流行性腹泻病毒Nsp7的亚细胞定位和对Ⅰ型干扰素应答的影响[J]. 李红杰,王晓雪,高冬生,黄慧敏,陈陆,常洪涛,王川庆,李永涛,赵军. 畜牧兽医学报. 2017(03)
[9]猪流行性腹泻病毒的分子生物学特性以及胰酶对其作用机理[J]. 张永香,陈海南,陈樨,张如梅. 福建畜牧兽医. 2016(03)
[10]胰酶对猪流行性腹泻病毒纤突蛋白作用的研究进展[J]. 朱俊辉,王军政,王一鸣,赵艳丽,王开,陈小庆,胡桂学. 中国兽药杂志. 2015(12)
本文编号：3534499
【文章来源】：浙江农林大学浙江省
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同胰酶浓度及病毒接种量下Vero细胞各时间段的CPE情况
PEDV感染细胞和猪小肠组织的转录组分析23virusinoculationTrypsinconcentration：A.2.5μg/mL；B.2.5μg/mL；C.5μg/mL；D.5μg/mLVirusinoculation：A.0.6MOI；B.1.2MOI；C.0.6MOI；D.1.2MOI2.2PEDV-YJH细胞感染试验及免疫组化结果实验所用PEDV毒株来源于浙江内规模化养殖场的临床腹泻样本，通过Vero细胞，分离出PEDV-YJH毒株，病毒传代条件为：病毒维持液是高糖DMEM中加入胰酶（不含EDTA）的浓度为5μg/mL；PEDV接种量为1.2MOI。传代至90代次后，测得病毒滴度为107TCID50/0.1mL。病毒接种Vero细胞后，20h开始出现少量CPE，48h出现大面积CPE，72h细胞基本全部裂解。如图所示，生长曲线显示PEDV-YJH在36h-72h达到对数生长期，免疫组化结果可看出小肠上皮细胞出现大面积凋亡情况。图2PEDV分离及生物学特征鉴定A.PEDV-YJH感染Vero细胞的CPE变化；B.PEDV-YJH的生长曲线；C.PEDV感染仔猪后肠道上皮细胞的组织病理变化。Figure2IsolationofPEDVandidentificationofbiologicalcharacteristicsA.CPEchangesofVerocellsinfectedwithPEDV-YJH;B.GrowthcurvesofPEDV-YJH;C.HistopathologicalchangesofintestinalepithelialcellsafterpigletsinfectedwithPEDV.2.3PEDV-YJH感染猪小肠组织LncRNA的表达谱分析PEDV-YJH（1×10-7TCID50/头）口服感染仔猪后，收集小肠样品进行二代转录组学测序。通过测序结果构建了mRNA差异表达谱和LncRNA差异表达谱，其中mRNA表达谱中有167条基因上调以及169条基因下调，LncRNA表达谱中则相对较少,共含有47条上调LncRNA和62条下调LncRNA。在差异表达的
PEDV感染细胞和猪小肠组织的转录组分析24lncRNA中选择9组与NF-κB信号通路相关联的，以这些lncRNA的靶向基因命名，分别为1.LncRNAMOCR1；2.LncRNAPKCE；3.LncRNACNOT1；4.LncRNAIFN-OMEGA；5.LncRNACDC42BPA；6.LncRNASUDS3；7.LncRNAPSMA5；8.LncRNAIL7；9.LncRNACACNA1E。括号中为转录组测序结果中与之相靶向的mRNA。使用预先设计好的引物进行实时荧光定量PCR验证。RT-PCR结果表明LncRNASUDS3与对照相比表达水平显著提高。图3仔猪小肠样品lncRNA差异表达谱A.PEDV感染仔猪后肠道组织LncRNA表达热点图；B.LncRNA的靶基因信号通路KEGG富集；C.病毒感染后mRNA以及LncRNA表达差异统计；D.荧光定量PCR验证LncRNA表达差异结果Figure3DifferentialexpressionoflncRNAinpigletsmallintestinesamplesA.HotspotsofLncRNAexpressioninintestinaltissuesafterPEDVinfectioninpiglets;B.KEGGenrichmentofLncRNAtargetgenesignalingpathway;C.StatisticsofmRNAandLncRNAexpressiondifferencesafterviralinfection;D.ResultsofLncRNAexpressiondifferencesverifiedbyfluorescencequantitativePCR2.4PEDV-YJH感染Vero细胞lncRNA表达差异分析用Vero细胞进行铺板，分成对照组和实验组，每组都设置0h、24h、48h三个时间点，每个时间点设置三个重复，进行转录组测序分析。我们发现不同时
【参考文献】：
期刊论文
[1]肺结核患者外周血单个核细胞NFκB1与LncRNA-PACER的表达关系研究[J]. 黄东轩,何朝文,廖毅力,彭剑锋,杨帆,曹亚辉,黄冬生. 海南医学院学报. 2020(04)
[2]中药阻断NF-κB信号通路抑制Ⅰ型单纯疱疹病毒感染的研究进展[J]. 綦鲁博,张保平. 中国医药导报. 2020(01)
[3]过表达SIRT1抑制脂多糖诱导的胰岛β细胞炎症因子表达及NF-κB信号通路激活[J]. 简磊,胡斌,高明杰. 免疫学杂志. 2019(08)
[4]与猪流行性腹泻病毒M蛋白互作的宿主蛋白的鉴定[J]. 王瑞阳,于瑞嵩,陈冰清,李凤平,谢春芳,司伏生,董世娟,李震. 微生物学通报. 2019(06)
[5]羊口疮病毒ORF128锚蛋白对HEK293T细胞NF-κB信号通路的调节作用及机制[J]. 安雪珂,贾怀杰,冯园,陈国华,何小兵,景志忠,王晓霞. 细胞与分子免疫学杂志. 2019(03)
[6]PEDV M蛋白对Ⅰ型干扰素信号通路的抑制作用[J]. 陈盼,李莎莎,朱紫祥,郑海学,徐志文. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2019(07)
[7]基于PEDV M基因RT-LAMP快速检测方法的建立与应用[J]. 陈希文,尹苗,汪谦,杨勤,杨凤,李莲,罗文涛,周杰珑,马缨,赵洪. 中国兽医学报. 2018(09)
[8]猪流行性腹泻病毒Nsp7的亚细胞定位和对Ⅰ型干扰素应答的影响[J]. 李红杰,王晓雪,高冬生,黄慧敏,陈陆,常洪涛,王川庆,李永涛,赵军. 畜牧兽医学报. 2017(03)
[9]猪流行性腹泻病毒的分子生物学特性以及胰酶对其作用机理[J]. 张永香,陈海南,陈樨,张如梅. 福建畜牧兽医. 2016(03)
[10]胰酶对猪流行性腹泻病毒纤突蛋白作用的研究进展[J]. 朱俊辉,王军政,王一鸣,赵艳丽,王开,陈小庆,胡桂学. 中国兽药杂志. 2015(12)
本文编号：3534499
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