PK-15细胞的TPL2基因敲除有利于口蹄疫病毒和塞内卡病毒复制
发布时间：2021-12-17 13:31
旨在构建TPL2（MAP3K8/COT）基因敲除PK-15细胞系PK-15-TPL2-/-,评估该基因敲除前后对口蹄疫病毒（FMDV）和塞内卡病毒（SVA）复制的影响及产生影响的原因,为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供良好的生物材料,也为疫苗生产过程中进一步提升FMDV和SVA产量指明方向。筛选2条针对TPL2基因的单向导RNA（sg RNA）,合成sg RNA并将其插入到含有GFP标签的慢病毒表达载体,构建sg RNA/Cas9慢病毒表达质粒,包装慢病毒并感染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞。通过测序确认细胞系中TPL2的DNA序列,通过蛋白质印迹（Western blot）方法检测细胞系中TPL2表达情况。使用FMDV和SVA感染构建好的细胞系,利用IFA、RT-qPCR、Western blot和TCID50评估FMDV和SVA在PK-15-TPL2-/-细胞中的复制水平,在此基础上通过测定干扰素（IFN）和IFN刺激基因（ISG）的mRNA表达水平,研究了FMDV或SVA...
【文章来源】：畜牧兽医学报. 2020,51(05)北大核心CSCD
【文章页数】：14 页
【部分图文】：
敲除TPL2基因的PK-15细胞系的建立
敲除TPL2显著增加FMDV和SVA复制,为了研究TPL2敲除促进FMDV和SVA复制的可能原因,利用RT-qPCR检测感染FMDV和SVA后不同时间PK-15细胞及PK-15-TPL2-/-细胞内干扰素(IFN)和IFN刺激基因(ISG)的mRNA表达水平。如图6所示,FMDV和SVA感染引起PK-15细胞内IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56 mRNA表达上调,这提示FMDV和SVA感染能够激活IFN信号。然而在FMDV和SVA感染的PK-15-TPL2-/-细胞内IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56 mRNA的表达明显降低,并且与时间不存在良好的相关性。这表明FMDV和SVA感染期间激活了干扰素信号通路,敲除TPL2能够抑制干扰素信号通路导致IFN-α、IFN-β和IFN-γ表达下调,同时抑制干扰素刺激基因ISG15、ISG54和ISG56的产生进而促进病毒的复制,在这个过程中是否还有其他因素参与,还有待进一步研究。3 讨 论
自19世纪80年代细菌限制性内切酶首次应用于DNA重组以来,基因编辑技术已有近40年历史[27-28]。但由于技术上的不成熟,在当时并没有被广泛应用。直到开发出操作方便、基因编辑功能精确并具有高性价比的工程核酸酶,该领域才取得重大进展[29]。目前ZNF、TALEN和CRISPR/Cas9三种基因编辑核酸内切酶已经应用于临床。其中,CRISPR/Cas9系统以其高效、快速、多功能、易用、低成本等优点,成为该领域应用最广泛的基因编辑技术,并已应用在各物种中[30]。本研究利用该技术成功构建了敲除TPL2基因的PK-15细胞系,Western blot分析表明,建立的细胞系中TPL2蛋白已完全敲除。随机选取1号细胞株进行功能评价,并将该细胞系命名为PK-15-TPL2-/-。图4 TPL2基因敲除促进SVA在PK-15细胞中的复制
本文编号：3540222
【文章来源】：畜牧兽医学报. 2020,51(05)北大核心CSCD
【文章页数】：14 页
【部分图文】：
敲除TPL2基因的PK-15细胞系的建立
敲除TPL2显著增加FMDV和SVA复制,为了研究TPL2敲除促进FMDV和SVA复制的可能原因,利用RT-qPCR检测感染FMDV和SVA后不同时间PK-15细胞及PK-15-TPL2-/-细胞内干扰素(IFN)和IFN刺激基因(ISG)的mRNA表达水平。如图6所示,FMDV和SVA感染引起PK-15细胞内IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56 mRNA表达上调,这提示FMDV和SVA感染能够激活IFN信号。然而在FMDV和SVA感染的PK-15-TPL2-/-细胞内IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56 mRNA的表达明显降低,并且与时间不存在良好的相关性。这表明FMDV和SVA感染期间激活了干扰素信号通路,敲除TPL2能够抑制干扰素信号通路导致IFN-α、IFN-β和IFN-γ表达下调,同时抑制干扰素刺激基因ISG15、ISG54和ISG56的产生进而促进病毒的复制,在这个过程中是否还有其他因素参与,还有待进一步研究。3 讨 论
自19世纪80年代细菌限制性内切酶首次应用于DNA重组以来,基因编辑技术已有近40年历史[27-28]。但由于技术上的不成熟,在当时并没有被广泛应用。直到开发出操作方便、基因编辑功能精确并具有高性价比的工程核酸酶,该领域才取得重大进展[29]。目前ZNF、TALEN和CRISPR/Cas9三种基因编辑核酸内切酶已经应用于临床。其中,CRISPR/Cas9系统以其高效、快速、多功能、易用、低成本等优点,成为该领域应用最广泛的基因编辑技术,并已应用在各物种中[30]。本研究利用该技术成功构建了敲除TPL2基因的PK-15细胞系,Western blot分析表明,建立的细胞系中TPL2蛋白已完全敲除。随机选取1号细胞株进行功能评价,并将该细胞系命名为PK-15-TPL2-/-。图4 TPL2基因敲除促进SVA在PK-15细胞中的复制
本文编号：3540222
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3540222.html
