利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联技术构建产肠毒素大肠杆菌LT敲除菌株
发布时间：2021-12-18 20:45
本研究旨在利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联的技术对产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）K88的热不稳定性肠毒素（heat-labile toxin,LT）基因进行无痕敲除并获得K88 LT-缺陷菌株。通过序列比对获取LT两端同源序列,并构建包含LT边界、氯霉素筛选标记、sgRNA和LT同源臂的供体片段;将供体片段转化至ETEC K88,同时分别利用λ-Red同源重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统,对LT基因进行敲除;通过PCR验证获得了K88 LT-缺陷菌株,并通过试验测定了敲除菌株的溶血能力和生长曲线。结果显示,λ-Red同源重组系统可成功地将LT基因替换为相应的供体片段,CRISPR/Cas9基因编辑系统可高效地对筛选标记进行删除,最终通过λ-Red和CRISPR/Cas9结合的基因编辑系统可成功对ETEC K88的LT基因进行无痕敲除。体外试验结果表明,K88 LT-缺陷菌株的溶血能力丧失,并且生长速度比野生型菌株减缓,LT可能和ETEC...
【文章来源】：中国畜牧兽医. 2020,47(03)北大核心
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
pCas-Red质粒图谱
通过引物LT-F/LT-R克隆LT基因全长,连接TA-克隆载体,转化感受态细胞。挑选单克隆,将经PCR验证筛选的阳性克隆测序,比对NCBI数据库,获得LT基因全长及其上、下游序列。根据LT基因及其上、下游序列设计其5′端同源臂序列L-arm short和L-arm,3′端同源臂序列R-arm。以DNA片段Cat-chl cassette为LT的替代基因,合成LT基因的供体LTh donar (L-arm+Cat-chl cassette+L-arm short+R-arm)(图2)。1.7 LTh donar转化
通过Red系统介导的HR插入Chl抗性基因CmR,用于筛选阳性的毒素基因LT替代克隆(图3)。制备含pCas-Red质粒电转感受态细胞,接种含pCas-Red质粒的ETEC K88阳性克隆子至50 mL含Amp和1%甘油的LB液体培养基中,于30 ℃、200 r/min培养2 h后,加入0.1 mmol/L IPTG诱导λ-RED蛋白的表达,30 ℃生长至D600 nm值为0.6左右,其他步骤同前。取50 μL含pCas-Red质粒的感受态细胞加入LT donar,转移至电转杯中混匀进行电转,条件同前。细胞在30 ℃复苏2 h,涂布于含Amp、氯霉素和1%甘油的LB培养基上,30 ℃培养12 h。挑取单克隆,通过引物LTh donor-F/R进行PCR验证LTh donar基因的插入。1.8 LT基因敲除菌株的筛选
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR-Cas9介导的蒙古牛MSTN基因敲除细胞系的建立[J]. 郭梓茹,张立,马云龙,苏小虎,周欢敏,张焱如,刘晓. 中国畜牧兽医. 2018(04)
[2]CRISPR-Cas9的原理及其应用进展[J]. 杨佳儒,郭美华,柳爱华,宝福凯. 昆明医科大学学报. 2016(05)
[3]利用CRISPR/Cas 9技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统及其初步应用[J]. 余深翼,赵金荣,郑玲红,朱二鹏,周五朵,吴宝成. 畜牧兽医学报. 2016(04)
[4]运用CRISPR/Cas系统敲除大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其对脂肪酸代谢的影响[J]. 夏军,郑明刚,王玲,孙承君,郑立,祝建波. 微生物学通报. 2016(08)
[5]肠毒性大肠杆菌gspD基因敲除以及对LT毒素分泌的影响[J]. 鲁曦,傅恩清,潘蕾,穆德广,李王平,金发光. 基因组学与应用生物学. 2015(12)
[6]应用siRNA技术抑制产肠毒素大肠杆菌LT基因表达的研究[J]. 付瑞,刘华,段勇,王玉明,单斌. 国际检验医学杂志. 2015(08)
[7]λ-Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞毒素stx2基因[J]. 刘变芳,殷先华,吕欣,魏新元,郭蔼光. 中国兽医学报. 2010(07)
[8]平板免疫溶血法检测产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素[J]. 杨正时,钟熙. 医学研究通讯. 1987(08)
硕士论文
[1]K88ac+大肠杆菌减毒株的构建及其在小鼠体内的初步应用[D]. 余树培.扬州大学 2016
本文编号：3543141
【文章来源】：中国畜牧兽医. 2020,47(03)北大核心
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
pCas-Red质粒图谱
通过引物LT-F/LT-R克隆LT基因全长,连接TA-克隆载体,转化感受态细胞。挑选单克隆,将经PCR验证筛选的阳性克隆测序,比对NCBI数据库,获得LT基因全长及其上、下游序列。根据LT基因及其上、下游序列设计其5′端同源臂序列L-arm short和L-arm,3′端同源臂序列R-arm。以DNA片段Cat-chl cassette为LT的替代基因,合成LT基因的供体LTh donar (L-arm+Cat-chl cassette+L-arm short+R-arm)(图2)。1.7 LTh donar转化
通过Red系统介导的HR插入Chl抗性基因CmR,用于筛选阳性的毒素基因LT替代克隆(图3)。制备含pCas-Red质粒电转感受态细胞,接种含pCas-Red质粒的ETEC K88阳性克隆子至50 mL含Amp和1%甘油的LB液体培养基中,于30 ℃、200 r/min培养2 h后,加入0.1 mmol/L IPTG诱导λ-RED蛋白的表达,30 ℃生长至D600 nm值为0.6左右,其他步骤同前。取50 μL含pCas-Red质粒的感受态细胞加入LT donar,转移至电转杯中混匀进行电转,条件同前。细胞在30 ℃复苏2 h,涂布于含Amp、氯霉素和1%甘油的LB培养基上,30 ℃培养12 h。挑取单克隆,通过引物LTh donor-F/R进行PCR验证LTh donar基因的插入。1.8 LT基因敲除菌株的筛选
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR-Cas9介导的蒙古牛MSTN基因敲除细胞系的建立[J]. 郭梓茹,张立,马云龙,苏小虎,周欢敏,张焱如,刘晓. 中国畜牧兽医. 2018(04)
[2]CRISPR-Cas9的原理及其应用进展[J]. 杨佳儒,郭美华,柳爱华,宝福凯. 昆明医科大学学报. 2016(05)
[3]利用CRISPR/Cas 9技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统及其初步应用[J]. 余深翼,赵金荣,郑玲红,朱二鹏,周五朵,吴宝成. 畜牧兽医学报. 2016(04)
[4]运用CRISPR/Cas系统敲除大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其对脂肪酸代谢的影响[J]. 夏军,郑明刚,王玲,孙承君,郑立,祝建波. 微生物学通报. 2016(08)
[5]肠毒性大肠杆菌gspD基因敲除以及对LT毒素分泌的影响[J]. 鲁曦,傅恩清,潘蕾,穆德广,李王平,金发光. 基因组学与应用生物学. 2015(12)
[6]应用siRNA技术抑制产肠毒素大肠杆菌LT基因表达的研究[J]. 付瑞,刘华,段勇,王玉明,单斌. 国际检验医学杂志. 2015(08)
[7]λ-Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞毒素stx2基因[J]. 刘变芳,殷先华,吕欣,魏新元,郭蔼光. 中国兽医学报. 2010(07)
[8]平板免疫溶血法检测产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素[J]. 杨正时,钟熙. 医学研究通讯. 1987(08)
硕士论文
[1]K88ac+大肠杆菌减毒株的构建及其在小鼠体内的初步应用[D]. 余树培.扬州大学 2016
本文编号：3543141
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