蜱凋亡抑制蛋白IAP的鉴定和RNA干扰研究
发布时间：2021-12-19 14:20
蜱是一类重要的吸血体外寄生虫,绝大多数寄生在哺乳动物体表,少数寄生在鸟类、爬行类及两栖类,蜱不但吸食大量血液,损害宿主皮肤,而且可以在叮咬过程中传播多种病原体,是人和动物许多重要疾病的传播媒介。在蜱的吸血过程当中,唾液腺是病原体传播给宿主的通道,是蜱及蜱传病防治中关键的靶器官。雌蜱的唾液腺在蜱吸血末期和饱血后会发生快速的退化,这一现象主要是由唾液腺细胞凋亡等程序化细胞死亡机制引起的。本论文选择唾液腺中发现的凋亡抑制分子（Inhibitor of Apoptosis Protein,IAP）,探索其在蜱唾液腺细胞凋亡的作用,并通过RNA干扰技术研究其功能和应用潜力。研究对象为镰形扇头蜱,一种大量分布于我国南部的优势蜱种,属于硬蜱家族,为三宿主蜱。根据实验室前期唾液腺转录组库的数据,设计引物,成功从半饱血成蜱唾液腺中扩增出镰形扇头蜱凋亡抑制分子（Rhipicephalus heamaphysaloides IAP,RhIAP）的基因编码序列,大小1887 bp,编码607个氨基酸,RhIAP的蛋白大小约66 kDa,有3个BIR结构域和一个RING指结构域。经由实时定量PCR方法检测了Rh...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
RhIAP扩增凝胶电泳结果
IAP的BIR1（第53-122氨基酸）和BIR2（第198-263氨基酸）分别含有70和66个氨基酸，它们之间相隔75个氨基酸，BIR3（第330-398氨基酸）包含69个氨基酸，与BIR2相隔66个氨基酸，接下来相隔155个氨基酸后是含有个氨基酸的RING值结构域（第554-607氨基酸）。图2-2测序后的RhIAP的全长基因序列及预测的氨基酸序列绿色，蓝色，黄色和红色网格分别是BIR1，BIR2，BIR3和RING指结构域。Fig.2-2.NucleotideandpredictedaminoacidsequencesofRhIAPTheBIR1,BIR2,BIR3andRINGfingerdomainsaresignedbygreen,blue,yellowandredgrid.图2-3测序后RhIAP核苷酸序列经NCBI网站预测结构域Fig.2-3TheconserveddomainanylisisresultofRhIAPsequencebyNCBI102030405060708090100110120130140150TACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTTTGCCTGGAGCCTACGCAGTTGTGAAACAGGAGGAATACCAGGAGGTGCGCCTTGGTTGCGTTAGGTTTCCCAAGTTGAATTTCGTTGCTGTTCACTCGGCTCCGCTGTTTCGTCT160170180190200210220230240250260270280290300GGACAGGATCGGCCTGTGTGGGGCCAGTCATCACGCAGAGAGGCGTGTACGATGGATAAGCCTAGAGCCAATGCGAGTGGTACAGGAAATCAGCGTGCTTTATCAATGACGCGGCGGTAAAATGAAATTTCCTGATAACCATTCACTGCT310320330340350360370380390400410420430440450CAGTTCGGCGTCCCGACTGCCGCACATCGAGCCTGTTGATGTGTTCAATGGCGTCTATGATGGTGGGCACGGCAGTGACGCAACGGGGGCCGCTCGCCTTCCCGGCATCTGAGCAGACGGTTCTGGATGGGTCCATGGGGGCAGTGGTGAMCSMASMMVGTAVTQRGPLAFPASEQTVLDGSMGAVVS460470480490500510520530540550560570580590600GCAAGTTCACCAAGATGGCCGGTACTGCTGACTATAGCCGAGAGGAACACAGGCTTCCCACTTTTAGTGAGTGGCCCCCAAACGCCCCAGTATCTGCGAAAAAGCTGGCCCAGGGTGGCTTTGTGTGTATTAACGCTTCCAGACTTCTGAKFTKMAGTADYSREEHRLPTFSEWPPNAPVSAKKLAQGGFV
sapiens，sp|P98170|；Ixodesscapularis，tr|B7Q7F6|；Ixodesricinus，tr|A0A147BHH1|；Bombyxmori，tr|E9JEI0|；Aedesaegypti，tr|Q175J8|；Drosophilamelanogaster，sp|Q24307|；Rhipicephalusappendiculatus，tr|A0A131YI84|。利用MEGA5，通过最大概似法构建进化树，结果显示镰形扇头蜱RhIAP与具尾扇头蜱关系最近，同源性高达87.81%，其次是两种硬蜱，肩突硬蜱54.07%，篦子硬蜱48.19%，接下来是三种节肢动物，果蝇32.64%，伊蚊32.21%，蚕31.61%，与哺乳动物同源性较低，家鼠28.67%，小鼠28.2%，人27.21%。图2-4系统进化树的构建Fig.2-4.phylogenetictreeofRhIAPfromdifferentorganismsbasedonaminoacidsequence2.5讨论凋亡抑制蛋白家族成员众多，分布广泛，从结构简单的原生动物到复杂的多细胞生物体，从有脊椎的哺乳动物到无脊椎的节肢动物都有IAP蛋白，而对于蜱尚未有关于凋亡抑制分子的研究。本研究选择在镰形扇头蜱唾液腺转录组文库中发现的一条凋亡抑制相关基因，根据其ORF设计引物，克隆获得了镰形扇头蜱的凋亡抑制蛋白基因序列，命名为RhIAP。获得的RhIAP是一个典型的有杆状病毒IAP重复序列的凋亡抑制分子，在C末端还有一个RING指结构域。根据序列同源性，IAP分子分为IAP1至IAP5五种类型(LUQUEetal.2001)，RhIAP与果蝇的DIAP2，其他物种的IAP2以及哺乳动物XIAP有相同的结构域构成，都有3个BIR结构域和一个RING指结构域，因此判断RhIAP也属于2型IAP分子。凋亡抑制分子主要分布在细胞核附近，所以一般不含有信号肽序列，通过软件分析发现RhIAP也不含有信号肽序列。将RhIAP与其他几种硬蜱、昆虫和哺乳动物的2型IAP进行同源性分析，结果显示RhIAP与其他硬蜱家族IAP2氨基酸序列的同源性并不算高，除了与具尾扇头蜱处在同一分支
本文编号：3544569
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
RhIAP扩增凝胶电泳结果
IAP的BIR1（第53-122氨基酸）和BIR2（第198-263氨基酸）分别含有70和66个氨基酸，它们之间相隔75个氨基酸，BIR3（第330-398氨基酸）包含69个氨基酸，与BIR2相隔66个氨基酸，接下来相隔155个氨基酸后是含有个氨基酸的RING值结构域（第554-607氨基酸）。图2-2测序后的RhIAP的全长基因序列及预测的氨基酸序列绿色，蓝色，黄色和红色网格分别是BIR1，BIR2，BIR3和RING指结构域。Fig.2-2.NucleotideandpredictedaminoacidsequencesofRhIAPTheBIR1,BIR2,BIR3andRINGfingerdomainsaresignedbygreen,blue,yellowandredgrid.图2-3测序后RhIAP核苷酸序列经NCBI网站预测结构域Fig.2-3TheconserveddomainanylisisresultofRhIAPsequencebyNCBI102030405060708090100110120130140150TACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTTTGCCTGGAGCCTACGCAGTTGTGAAACAGGAGGAATACCAGGAGGTGCGCCTTGGTTGCGTTAGGTTTCCCAAGTTGAATTTCGTTGCTGTTCACTCGGCTCCGCTGTTTCGTCT160170180190200210220230240250260270280290300GGACAGGATCGGCCTGTGTGGGGCCAGTCATCACGCAGAGAGGCGTGTACGATGGATAAGCCTAGAGCCAATGCGAGTGGTACAGGAAATCAGCGTGCTTTATCAATGACGCGGCGGTAAAATGAAATTTCCTGATAACCATTCACTGCT310320330340350360370380390400410420430440450CAGTTCGGCGTCCCGACTGCCGCACATCGAGCCTGTTGATGTGTTCAATGGCGTCTATGATGGTGGGCACGGCAGTGACGCAACGGGGGCCGCTCGCCTTCCCGGCATCTGAGCAGACGGTTCTGGATGGGTCCATGGGGGCAGTGGTGAMCSMASMMVGTAVTQRGPLAFPASEQTVLDGSMGAVVS460470480490500510520530540550560570580590600GCAAGTTCACCAAGATGGCCGGTACTGCTGACTATAGCCGAGAGGAACACAGGCTTCCCACTTTTAGTGAGTGGCCCCCAAACGCCCCAGTATCTGCGAAAAAGCTGGCCCAGGGTGGCTTTGTGTGTATTAACGCTTCCAGACTTCTGAKFTKMAGTADYSREEHRLPTFSEWPPNAPVSAKKLAQGGFV
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