玉米麸皮木聚糖降解酶基因挖掘与分子改良
发布时间：2021-12-29 16:30
木聚糖酶能够将半纤维素中木聚糖水解为单糖和寡糖,已广泛应用于多个领域。玉米的加工副产物玉米麸皮作为重要的饲料原料,木聚糖含量丰富,但结构极为复杂,难以被传统木聚糖酶降解。本研究以实验室保存的嗜酸黑曲霉Aspergillus niger MJ5和购买的八株镰刀菌为材料,用添加了玉米麸皮的盐离子培养基进行降解玉米麸皮木聚糖的产酶菌株筛选。以玉米麸皮木聚糖为底物通过对培养液上清进行酶活力测定,发现嗜酸黑曲霉A.niger MJ5和禾谷镰孢菌Fusarium graminearum 2697的培养液上清有较高的玉米麸皮木聚糖酶活性。根据基因组测序结果,从这两株菌中筛选到15个GH5和GH10家族的木聚糖酶基因,尝试克隆并在毕赤酵母中进行表达。从A.niger MJ5中克隆得到了11个可能的GH5和GH10家族木聚糖酶基因,GH10家族的木聚糖酶基因Anxyn10A在毕赤酵母中表达后检测到玉米麸皮木聚糖酶活性。重组AnXYN10A最适pH为5.0,最适温度为60°C,以小麦阿拉伯木聚糖为底物时其比活为2507 U/mg,Km和Vmax分别为5.67 m...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同植物组织来源的木聚糖结构(Evaetal.,2018)
拉伯木聚糖为主(SAULNIERetal.,1999)，分析表明玉米麸皮木聚糖的侧链取代程度高达85%，高于高粱的70%(CHANIAUDetal.,1995)。玉米麸皮木聚糖中阿拉伯呋喃糖基在主链木糖的C-2或C-3位置可以分别或同时发生取代，这种取代通常以短链形式存在。主链木糖在被阿拉伯呋喃糖取代的基础上可以进一步被木糖和L-半乳糖取代，D-吡喃半乳糖基和D-葡糖醛酸残基也可以直接在主链木糖上发生取代(SAULNIERetal.,1995)，除了形成糖苷键的取代外，阿拉伯木聚糖也可以被酯化，如被乙酸和阿魏酸取代(WILLIAMSONetal.,1998)。图1-2玉米麸皮木聚糖的结构(AGGERetal.,2010)Fig1-2structureofcornbranxylan1.1.3木聚糖的提取植物细胞壁中木聚糖通常与纤维素和木质素分别以氢键和共价键相互交联，因此难以被分离开来，为了便于科学研究及实现生物质的高值化利用，目前发展出了碱法﹑蒸汽爆破法﹑二甲基亚砜抽提法﹑微波辅助法等来获得木聚糖(KOOTSTRAetal.,2009;TEMOURIetal.,2005;HASSANetal.,2018)。碱法是通过将生物质原料通过脱脂﹑脱淀粉处理后烘干粉碎，然后用NaOH进行抽提，使其中的半纤维素成分溶于稀碱中，调节抽提液的pH后用乙醇沉淀的方法获取木聚糖。蒸汽爆破法是在高温高压的水蒸气条件下处理生物质原料，水蒸气能够穿透细胞壁断开半缩醛键并且破坏木聚糖链上的乙酰基生成酸，此过程不需额外加入化学试剂。二甲基亚砜抽提相比于碱抽提能够保留木聚糖中的乙酰基，有助于保持木聚糖的完整结构。微波辅助法是通过周期性变化的电磁波使生物质原料中的分子间发生碰撞产热达到原料中各组分分离的目的，该方法效率高，节省时间。
还具有良好的耐热（120°C加热1h仍保持稳定）和耐酸性（pH2.5-pH8.0稳定），能够促进脂类代谢，增加动物对钙﹑铁﹑镁等矿物质的吸收，能够清除自由基从而表现出抗氧化活性(BIANetal.,2013;WANGetal.,2011)，以及提高饲料的利用率，通过增殖双歧杆菌还能抑制能够产生有毒代谢产物胺﹑酚﹑吲哚等致癌物的腐生菌的生长，进而降低肠癌发生率(SCHEPPACHetal.,2001)。低聚木糖的完全降解产物木糖还可以作为一些菌株的发酵原料用于生物燃料乙醇的生产(ALMEIDAetal.,2013)，目前在食品﹑饲料﹑保健品﹑药品中都已广泛使用。图1-3低聚木糖结构示意图Fig1-3StructureofXylooligosaccharides1.2.2低聚木糖的获取低聚木糖的生产原料主要是富含半纤维素的低附加值的工农业加工副产物，如玉米芯，甘蔗渣，小麦和玉米秸秆，酒糟等。因为它们含有大量的木聚糖，且价格低廉，因此是制备低聚木糖的理想材料。目前低聚木糖的生产方法主要有酸水解法﹑自水解法﹑微波降解法﹑酶水解法（冷小军，2020）。酸水解法虽然效率高，再现性好，但其水解进程不易控制，通常会产生单糖及单糖降解产物。自水解法生成的单糖及其降解产物少，不会对设备造成腐蚀性，但通常需要在高温高压的条件下进行，其成本较高。微波法对设备要求较高，目前还无法进行工业化生产。而酶法
【参考文献】：
期刊论文
[1]低聚木糖的生产及应用研究进展[J]. 冷小军. 农产品加工. 2020(01)
[2]玉米皮纤维发酵裂褶菌的产酶分析及木聚糖酶基因克隆、表达和酶学性质测定[J]. 王靖宇,刘玉春,韩伟,庄绪会,李晓敏,陈新,张晓琳. 食品与发酵工业. 2018(05)
[3]木聚糖酶的分子改造方法及其工业应用研究现状[J]. 张燕青,张超群,王浩猛. 中国酿造. 2018(01)
[4]C-端引入二硫键对黑曲霉木聚糖酶XynZF-2热稳定性的影响[J]. 李婧逸,任冰洁,蔡刘滕子,张米帅,周晨妍. 基因组学与应用生物学. 2017(12)
[5]微滴数字PCR技术在多拷贝木聚糖酶酿酒酵母工程菌筛选中的应用[J]. 兰雪,张斯童,李哲,常浩,孙旸,王刚,陈欢,王春凤,陈光. 食品科学. 2018(10)
[6]引入盐桥改善木聚糖酶AoXyn11A的温度特性[J]. 吴芹,臧嘉,李闯,王瑞,邬敏辰. 食品与发酵工业. 2016(07)
[7]ARTP诱变筛选匍枝根霉提高木聚糖酶活力研究[J]. 党同学,张庆庆,汤文晶,程亚运. 安徽工程大学学报. 2016(02)
[8]木聚糖酶-甘露聚糖酶融合酶基因Linker优化及其在猪肾pK15细胞中共表达[J]. 张献伟,张冠冠,吴珍芳,孟繁明,刘德武,张茂,许卫华,郑恩琴,贺晓燕,李真,李紫聪. 中国农业科学. 2013(22)
[9]木聚糖酶基因克隆和表达的研究进展[J]. 王丹丹,周晨妍,付冠华. 中国生物制品学杂志. 2013(08)
[10]木聚糖酶的应用及其研究进展[J]. 叶世超,薛婷,何文锦,叶冰莹,魏芳,陈由强. 中国酿造. 2013(07)
博士论文
[1]Aspergillus fumigatus FC2-2木聚糖酶AfxynA的纯化、基因表达及定点突变研究[D]. 杨齐.广西大学 2015
[2]不同环境中木聚糖酶基因多样性分析及宏基因组来源的新基因克隆与表达[D]. 王国增.中国农业科学院 2011
[3]来源于橄榄绿链霉菌A1的木聚糖酶XYNB的分子改良[D]. 杨浩萌.中国农业科学院 2006
[4]来源于橄榄绿链霉菌A1的高比活木聚糖酶在植物中的高效表达[D]. 杨培龙.中国农业科学院 2005
硕士论文
[1]小麦芽内切-β-（1,4）-D-木聚糖酶对麸皮中水溶性木聚糖降解作用[D]. 张斌.山东农业大学 2016
本文编号：3556482
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同植物组织来源的木聚糖结构(Evaetal.,2018)
拉伯木聚糖为主(SAULNIERetal.,1999)，分析表明玉米麸皮木聚糖的侧链取代程度高达85%，高于高粱的70%(CHANIAUDetal.,1995)。玉米麸皮木聚糖中阿拉伯呋喃糖基在主链木糖的C-2或C-3位置可以分别或同时发生取代，这种取代通常以短链形式存在。主链木糖在被阿拉伯呋喃糖取代的基础上可以进一步被木糖和L-半乳糖取代，D-吡喃半乳糖基和D-葡糖醛酸残基也可以直接在主链木糖上发生取代(SAULNIERetal.,1995)，除了形成糖苷键的取代外，阿拉伯木聚糖也可以被酯化，如被乙酸和阿魏酸取代(WILLIAMSONetal.,1998)。图1-2玉米麸皮木聚糖的结构(AGGERetal.,2010)Fig1-2structureofcornbranxylan1.1.3木聚糖的提取植物细胞壁中木聚糖通常与纤维素和木质素分别以氢键和共价键相互交联，因此难以被分离开来，为了便于科学研究及实现生物质的高值化利用，目前发展出了碱法﹑蒸汽爆破法﹑二甲基亚砜抽提法﹑微波辅助法等来获得木聚糖(KOOTSTRAetal.,2009;TEMOURIetal.,2005;HASSANetal.,2018)。碱法是通过将生物质原料通过脱脂﹑脱淀粉处理后烘干粉碎，然后用NaOH进行抽提，使其中的半纤维素成分溶于稀碱中，调节抽提液的pH后用乙醇沉淀的方法获取木聚糖。蒸汽爆破法是在高温高压的水蒸气条件下处理生物质原料，水蒸气能够穿透细胞壁断开半缩醛键并且破坏木聚糖链上的乙酰基生成酸，此过程不需额外加入化学试剂。二甲基亚砜抽提相比于碱抽提能够保留木聚糖中的乙酰基，有助于保持木聚糖的完整结构。微波辅助法是通过周期性变化的电磁波使生物质原料中的分子间发生碰撞产热达到原料中各组分分离的目的，该方法效率高，节省时间。
还具有良好的耐热（120°C加热1h仍保持稳定）和耐酸性（pH2.5-pH8.0稳定），能够促进脂类代谢，增加动物对钙﹑铁﹑镁等矿物质的吸收，能够清除自由基从而表现出抗氧化活性(BIANetal.,2013;WANGetal.,2011)，以及提高饲料的利用率，通过增殖双歧杆菌还能抑制能够产生有毒代谢产物胺﹑酚﹑吲哚等致癌物的腐生菌的生长，进而降低肠癌发生率(SCHEPPACHetal.,2001)。低聚木糖的完全降解产物木糖还可以作为一些菌株的发酵原料用于生物燃料乙醇的生产(ALMEIDAetal.,2013)，目前在食品﹑饲料﹑保健品﹑药品中都已广泛使用。图1-3低聚木糖结构示意图Fig1-3StructureofXylooligosaccharides1.2.2低聚木糖的获取低聚木糖的生产原料主要是富含半纤维素的低附加值的工农业加工副产物，如玉米芯，甘蔗渣，小麦和玉米秸秆，酒糟等。因为它们含有大量的木聚糖，且价格低廉，因此是制备低聚木糖的理想材料。目前低聚木糖的生产方法主要有酸水解法﹑自水解法﹑微波降解法﹑酶水解法（冷小军，2020）。酸水解法虽然效率高，再现性好，但其水解进程不易控制，通常会产生单糖及单糖降解产物。自水解法生成的单糖及其降解产物少，不会对设备造成腐蚀性，但通常需要在高温高压的条件下进行，其成本较高。微波法对设备要求较高，目前还无法进行工业化生产。而酶法
【参考文献】：
期刊论文
[1]低聚木糖的生产及应用研究进展[J]. 冷小军. 农产品加工. 2020(01)
[2]玉米皮纤维发酵裂褶菌的产酶分析及木聚糖酶基因克隆、表达和酶学性质测定[J]. 王靖宇,刘玉春,韩伟,庄绪会,李晓敏,陈新,张晓琳. 食品与发酵工业. 2018(05)
[3]木聚糖酶的分子改造方法及其工业应用研究现状[J]. 张燕青,张超群,王浩猛. 中国酿造. 2018(01)
[4]C-端引入二硫键对黑曲霉木聚糖酶XynZF-2热稳定性的影响[J]. 李婧逸,任冰洁,蔡刘滕子,张米帅,周晨妍. 基因组学与应用生物学. 2017(12)
[5]微滴数字PCR技术在多拷贝木聚糖酶酿酒酵母工程菌筛选中的应用[J]. 兰雪,张斯童,李哲,常浩,孙旸,王刚,陈欢,王春凤,陈光. 食品科学. 2018(10)
[6]引入盐桥改善木聚糖酶AoXyn11A的温度特性[J]. 吴芹,臧嘉,李闯,王瑞,邬敏辰. 食品与发酵工业. 2016(07)
[7]ARTP诱变筛选匍枝根霉提高木聚糖酶活力研究[J]. 党同学,张庆庆,汤文晶,程亚运. 安徽工程大学学报. 2016(02)
[8]木聚糖酶-甘露聚糖酶融合酶基因Linker优化及其在猪肾pK15细胞中共表达[J]. 张献伟,张冠冠,吴珍芳,孟繁明,刘德武,张茂,许卫华,郑恩琴,贺晓燕,李真,李紫聪. 中国农业科学. 2013(22)
[9]木聚糖酶基因克隆和表达的研究进展[J]. 王丹丹,周晨妍,付冠华. 中国生物制品学杂志. 2013(08)
[10]木聚糖酶的应用及其研究进展[J]. 叶世超,薛婷,何文锦,叶冰莹,魏芳,陈由强. 中国酿造. 2013(07)
博士论文
[1]Aspergillus fumigatus FC2-2木聚糖酶AfxynA的纯化、基因表达及定点突变研究[D]. 杨齐.广西大学 2015
[2]不同环境中木聚糖酶基因多样性分析及宏基因组来源的新基因克隆与表达[D]. 王国增.中国农业科学院 2011
[3]来源于橄榄绿链霉菌A1的木聚糖酶XYNB的分子改良[D]. 杨浩萌.中国农业科学院 2006
[4]来源于橄榄绿链霉菌A1的高比活木聚糖酶在植物中的高效表达[D]. 杨培龙.中国农业科学院 2005
硕士论文
[1]小麦芽内切-β-（1,4）-D-木聚糖酶对麸皮中水溶性木聚糖降解作用[D]. 张斌.山东农业大学 2016
本文编号：3556482
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