采用转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组方法分析鸡卵泡选择的分子机制
发布时间：2021-12-31 22:54
母鸡的卵泡发育受多种激素的调控,是鸡产蛋性状的分子生物学基础。在产蛋高峰期的母鸡卵巢中,8-13个直径为6-8mm的小黄卵泡中有一个经选择进入等级卵泡阶段,快速生长发育直至排卵,即为卵泡选择。卵泡选择是维持正常产蛋的关键过程,目前已有研究证明多种激素、生长因子及其受体参与卵泡选择,调控卵泡的发育。对鸡卵泡选择分子机制的研究,有助于鉴定鸡及其它家禽产蛋性状的关键基因,为提高鸡的产蛋和繁殖性能提供理论依据。为了进一步揭示鸡卵泡选择的分子机制,本研究对等级前卵泡（6-8mm小黄卵泡,S）和刚进入等级发育的卵泡（12-15mm卵泡,一般为F6,F）进行了转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组的测序和生物信息学分析,鉴定出两个发育时期卵泡的差异表达基因、蛋白和蛋白磷酸化位点,进一步分析了影响卵泡选择的基因和蛋白质,以及在鸡卵泡选择过程的作用机制。结果如下:（1）鸡小黄卵泡与F6卵泡的转录组学分析。转录组测序共检测到20,679个表达基因,以|log2（FoldChange）|>1和padj<0.05为筛选差异基因的标准,共筛选到差异表达基因855个,其中上调基因202个,下调基因653个。...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：108 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
产蛋鸡腹腔中发育不同时期的各级卵泡（Wangetal.,2017）
采用转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组方法分析鸡卵泡选择的分子机制22（6）在沉淀中加入1mL70%乙醇，轻轻振荡让沉淀飘起，4℃7500×g离心5min，洗涤RNA，弃掉乙醇。（7）将离心管盖打开，室温晾干后，加入50μL无RNA酶水溶解，-80℃冰箱保存。（8）RNA质量及浓度检测：用紫外分光光度计检测A260/A280、A260/A230的值，并用电泳检测RNA的质量和浓度。2.2.1.2转录组文库构建与测序转录组文库的构建由北京诺禾致源生物信息科技有限公司（Novogene，Beijing）完成。利用Illumina的NEBNextUltraTMRNALibraryPrepKit。通过Oligo(dT)磁珠富集带有polyA尾的mRNA，合成cDNA片段，经过末端修复和纯化连接，用AMPureXPbeads筛选筛选250-300bp左右的cDNA，获得文库质检合格后进行Illumina测序。本研究中转录组建库测序流程如下：图2-1转录组测序流程（北京诺禾致源）Fig.2-1TheworkflowofRNA-seq（Novogene）2.2.1.3信息分析流程去除测序获得的原始数据中质量低的reads，获得后续分析是用的cleanreads。测序质量利用Q20（测序错误率1%碱基数目比）和Q30（测序错误率0.1%的碱基数目比）衡量，并对cleanreads序列与参考序列进行比对。随后进行定量，差异显著性分析，功
山东农业大学博士学位论文23能富集等分析。信息分析流程如图2-2所示。测序获得的转录组数据上传到NCBISequenceReadArchive（SRA,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/docs/），登陆号为SRP236909。图2-2转录组生物信息分析流程图Fig.2-2Theworkflowoftranscriptionalbioinformaticsanalysis2.2.1.4测序数据注释使用HISAT2v2.0.5软件（Mortazavietal.,2008）将CleanReads与参考基因组鸡（Gallusgallus）进行快速精确的比对，获取Reads在参考基因组上的定位信息，并将比对上的reads进行分类注释。2.2.1.5基因表达分析使用subread软件中的featureCounts工具（Liaoetal.,2014），根据基因比对在参考基因组上的位置信息，分别过滤掉比对质量值低于10的reads、非成对比对上的reads和比对到基因组多个区域的reads，从而统计每个基因从起始到终止范围内覆盖的reads数目。FPKM（FragmentsPerKilobaseoftranscriptperMillionfragmentsmapped）指每百万碱基对测序的转录本序列片段的每千碱基片段的预期数量，作为衡量转录本或基因表达水平的指标（Trapnelletal.,2010）。对样品进行重复性验证。用皮尔逊相关系数的平方(R2)来反映两个变量线性相关程度,其绝对值越大，表示相关性越强。据各样本所有基因的FPKM值计算组内及组间样
【参考文献】：
期刊论文
[1]KDM1A在牦牛卵泡发育过程中的表达[J]. 黄向月,熊显荣,韩杰,杨显英,王艳,王斌,李键. 中国农业科学. 2019(24)
[2]蛋白质翻译后修饰研究进展[J]. 阮班军,代鹏,王伟,孙建斌,张文涛,颜真,杨静华. 中国细胞生物学学报. 2014(07)
[3]修饰蛋白质组学分离鉴定新技术新方法[J]. 宋春侠,孙珍,秦洪强,叶明亮,张丽华,张玉奎,邹汉法. 科学通报. 2013(30)
[4]Effect of epidermal growth factor on follicle-stimulating hormone-induced proliferation of granulosa cells from chicken prehierarchical follicles[J]. Jin-xing LIN,Yu-dong JIA,Cai-qiao ZHANG(Key Laboratory of Animal Epidemic Etiology & Immunological Prevention of the Ministry of Agriculture,Department of Veterinary Medicine,College of Animal Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China). Journal of Zhejiang University-Science B（Biomedicine & Biotechnology）. 2011(11)
[5]转录组研究新技术:RNA-Seq及其应用[J]. 祁云霞,刘永斌,荣威恒. 遗传. 2011(11)
[6]雌禽生殖生理研究进展[J]. 李碧春,秦洁. 中国畜牧兽医. 2006(01)
[7]磷酸化蛋白质分析技术在蛋白质组研究中的应用[J]. 王京兰,钱小红. 分析化学. 2005(07)
[8]筛选差异表达基因和蛋白质的方法进展[J]. 王吉村,药立波,赵忠良. 生物化学与生物物理进展. 2001(01)
[9]禽类卵泡生殖内分泌机能及其调控[J]. 刘林. 动物学杂志. 1990(04)
硕士论文
[1]高邮鸭VLDLR基因的序列分析及其多态性与生长和屠宰性状的相关性研究[D]. 赵南南.扬州大学 2015
本文编号：3561134
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：108 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
产蛋鸡腹腔中发育不同时期的各级卵泡（Wangetal.,2017）
采用转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组方法分析鸡卵泡选择的分子机制22（6）在沉淀中加入1mL70%乙醇，轻轻振荡让沉淀飘起，4℃7500×g离心5min，洗涤RNA，弃掉乙醇。（7）将离心管盖打开，室温晾干后，加入50μL无RNA酶水溶解，-80℃冰箱保存。（8）RNA质量及浓度检测：用紫外分光光度计检测A260/A280、A260/A230的值，并用电泳检测RNA的质量和浓度。2.2.1.2转录组文库构建与测序转录组文库的构建由北京诺禾致源生物信息科技有限公司（Novogene，Beijing）完成。利用Illumina的NEBNextUltraTMRNALibraryPrepKit。通过Oligo(dT)磁珠富集带有polyA尾的mRNA，合成cDNA片段，经过末端修复和纯化连接，用AMPureXPbeads筛选筛选250-300bp左右的cDNA，获得文库质检合格后进行Illumina测序。本研究中转录组建库测序流程如下：图2-1转录组测序流程（北京诺禾致源）Fig.2-1TheworkflowofRNA-seq（Novogene）2.2.1.3信息分析流程去除测序获得的原始数据中质量低的reads，获得后续分析是用的cleanreads。测序质量利用Q20（测序错误率1%碱基数目比）和Q30（测序错误率0.1%的碱基数目比）衡量，并对cleanreads序列与参考序列进行比对。随后进行定量，差异显著性分析，功
山东农业大学博士学位论文23能富集等分析。信息分析流程如图2-2所示。测序获得的转录组数据上传到NCBISequenceReadArchive（SRA,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/docs/），登陆号为SRP236909。图2-2转录组生物信息分析流程图Fig.2-2Theworkflowoftranscriptionalbioinformaticsanalysis2.2.1.4测序数据注释使用HISAT2v2.0.5软件（Mortazavietal.,2008）将CleanReads与参考基因组鸡（Gallusgallus）进行快速精确的比对，获取Reads在参考基因组上的定位信息，并将比对上的reads进行分类注释。2.2.1.5基因表达分析使用subread软件中的featureCounts工具（Liaoetal.,2014），根据基因比对在参考基因组上的位置信息，分别过滤掉比对质量值低于10的reads、非成对比对上的reads和比对到基因组多个区域的reads，从而统计每个基因从起始到终止范围内覆盖的reads数目。FPKM（FragmentsPerKilobaseoftranscriptperMillionfragmentsmapped）指每百万碱基对测序的转录本序列片段的每千碱基片段的预期数量，作为衡量转录本或基因表达水平的指标（Trapnelletal.,2010）。对样品进行重复性验证。用皮尔逊相关系数的平方(R2)来反映两个变量线性相关程度,其绝对值越大，表示相关性越强。据各样本所有基因的FPKM值计算组内及组间样
【参考文献】：
期刊论文
[1]KDM1A在牦牛卵泡发育过程中的表达[J]. 黄向月,熊显荣,韩杰,杨显英,王艳,王斌,李键. 中国农业科学. 2019(24)
[2]蛋白质翻译后修饰研究进展[J]. 阮班军,代鹏,王伟,孙建斌,张文涛,颜真,杨静华. 中国细胞生物学学报. 2014(07)
[3]修饰蛋白质组学分离鉴定新技术新方法[J]. 宋春侠,孙珍,秦洪强,叶明亮,张丽华,张玉奎,邹汉法. 科学通报. 2013(30)
[4]Effect of epidermal growth factor on follicle-stimulating hormone-induced proliferation of granulosa cells from chicken prehierarchical follicles[J]. Jin-xing LIN,Yu-dong JIA,Cai-qiao ZHANG(Key Laboratory of Animal Epidemic Etiology & Immunological Prevention of the Ministry of Agriculture,Department of Veterinary Medicine,College of Animal Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China). Journal of Zhejiang University-Science B（Biomedicine & Biotechnology）. 2011(11)
[5]转录组研究新技术:RNA-Seq及其应用[J]. 祁云霞,刘永斌,荣威恒. 遗传. 2011(11)
[6]雌禽生殖生理研究进展[J]. 李碧春,秦洁. 中国畜牧兽医. 2006(01)
[7]磷酸化蛋白质分析技术在蛋白质组研究中的应用[J]. 王京兰,钱小红. 分析化学. 2005(07)
[8]筛选差异表达基因和蛋白质的方法进展[J]. 王吉村,药立波,赵忠良. 生物化学与生物物理进展. 2001(01)
[9]禽类卵泡生殖内分泌机能及其调控[J]. 刘林. 动物学杂志. 1990(04)
硕士论文
[1]高邮鸭VLDLR基因的序列分析及其多态性与生长和屠宰性状的相关性研究[D]. 赵南南.扬州大学 2015
本文编号：3561134
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