猪Gp96N增强PRRSV合成肽疫苗、亚单位疫苗及PCV2灭活疫苗免疫效应的分析
发布时间：2022-01-02 11:51
Gp96是热休克蛋白HSP90家族一员,具有多种免疫学效应,包括提高抗原呈递、刺激抗原呈递细胞（APCs）产生细胞因子、激发机体特异性免疫应答及细胞毒性T细胞（CTL）反应,以及免疫佐剂效应。本论文主要研究猪Gp96N对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的B、T细胞表位合成肽疫苗、B细胞表位串联亚单位疫苗以及猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）灭活疫苗的免疫佐剂效应。首先建立了表达猪Gp96N的大肠杆菌和毕赤酵母p.pastoris-X33表达系统,利用纯化的猪Gp96N作为免疫佐剂,在小鼠和猪上,从细胞免疫、体液免疫和天然免疫角度,分析了猪Gp96N对上述三种疫苗的免疫增强效应。研究结果为猪Gp96N作为免疫佐剂在疫苗中的应用提供了科学依据。从猪肾脏中提取RNA,采用RT-PCR扩增得到猪Gp96N基因cDNA片段,分别插入载体pET-32a和pPICZαA中,构建出原核表达载体pET-32a/Gp96N和真核表达载体pPICZaA/Gp96N,分别转入大肠杆菌BL21和毕赤酵母p.pastoris-X33中,经抗性筛选获得重组大肠杆菌BL21/pET-32a/Gp96N和重组毕赤酵母p.p...
【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：99 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
大肠表达猪Gp96N的基因克隆（A)、SDS-PAGE(B)和Westerblot检测结果（C)
3.2.1 PCR扩増得到猪Gp96N基因以pET-32a/Gp96N为模板，经PCR扩增得到1002bp左右的片段（图2-2)，与预期相符，表明PCR扩增得到猪Gp%N基M(bp) 130(%■靈免,交■？f^r?- ^图2-2酵母菌表达猪Gp96N的基因克隆Fig.2-2 PCR product of Gp96N gene. M: DNA marker ； 1 :Gp96N gene3.2.2构建得到毕赤酵姆表达质粒pPICZaA/Gp96N将PCR扩增得到的猪Gp%N基闪片段勾载体pPICZaA用A7;o /和Xk//双酶切，纯化冋收酶切产物，WT4DNA连接酶反应1211构建重组表达质粒pPICZaA-Gp96N，转化人肠杆歯DH5a感受态细胞，获得重组歯。挑取重组歯单克隆，提取质粒，表达质粒pPICZaA-Gp%N经/和/双酶切后，电泳检测结果如图2-3所示
.15统计学分析釆用r检验法比较各组之W的差异，/^>0.05代表差兄显著；*尸<0.05代表差兄显著；**尸<0.01表差兄非常显著；***P<0.001代表差兄极显著。结果与分析.1 PRRSV的B细胞表位和T细胞表位的序列分析选样2条文献报道的能被PRRSV中和抗体识别的B细胞表位Gp4-59B和Gp5-37B，以及7条RRSV的T细胞抗原表位（表3-1)。然后，从GeneBank t下载了大量II哨PRRSV毒株的GP4(379）、GP5 (1001条）和N蛋(226条）序列，利用Weblogo软件对这些表位的氨基酸进行保守性析，结果如图3-1所示，除GP4-59B变兄性较大外，其他8条序列（GP5-37B、GP4-7T、GP4-170T、P5-149T、GP5-U7T、N-49T、N-63T和N-104T)均丨?分保守。利用DNAStar软件分析表位的抗原发现GP5-37B、GP4-7T和GP4-170T的抗原性较差，其他6条表位的抗原性均较商（图3-1)。因，报据保守性分析结果合成这些表位多肽。S % e T I N k I s (;p4-l70'^;< ■ ? * ? i ? t r i
【参考文献】：
期刊论文
[1]昆虫热激蛋白90的研究进展[J]. 张珂,翁群芳,付昊昊. 生物技术通报. 2014(02)
[2]热休克蛋白在肝细胞癌形成、增殖、复发、转移及抗肿瘤免疫中的作用研究[J]. 吴嘉仪,李高鹏,罗葆明. 岭南现代临床外科. 2013(04)
[3]IFN-α对gp96的上调降低其抗HBV的效率[J]. 郜衍周,范红霞,邱立鹏,孟颂东. 微生物学报. 2013(08)
[4]犬GM-CSF基因对犬细小病毒VP2DNA疫苗的免疫增强作用[J]. 贾启恒,温洁霞,王利月,林洪羽,张峰,王璐,孙岩,李秀锦,仲飞. 中国兽医学报. 2013(05)
[5]疫苗佐剂的研究现状和发展趋势[J]. 李娜,周伟芳,刘慧敏,李赞,仇华吉. 中国预防兽医学报. 2013(01)
[6]热激蛋白gp96免疫学功能及在主动免疫治疗肿瘤和传染病中的应用[J]. 徐亚星,王赛锋,张小俊,孟颂东. 生物工程学报. 2012(03)
[7]Gp96蛋白的免疫学及其临床应用研究进展[J]. 陈才伟,贾晓娟,孟颂东,刘文军. 生物工程学报. 2011(05)
[8]细菌脂多糖诱导巨噬细胞NO信号分子释放的研究进展[J]. 赵娟,刘扬,冯琳,周小秋. 黑龙江畜牧兽医. 2011(03)
[9]脂质体制剂在医疗中的应用现状[J]. 陆书华,杨兴光. 中国病原生物学杂志. 2010(12)
[10]IL-12及其免疫调节作用[J]. 孙敬,洪杰华,郑世民. 动物医学进展. 2010(02)
博士论文
[1]中链脂肪酸甘油三酯作为免疫佐剂的免疫效果的研究和应用[D]. 李丽杰.中国海洋大学 2013
硕士论文
[1]纳微球新型佐剂对HPV L1五聚体蛋白的包埋及其免疫效应的研究[D]. 贾成成.华南理工大学 2013
[2]细胞因子对PCV2-Cap蛋白免疫增强作用及Cap与FMDV-Vp1共表达产物免疫原性鉴定[D]. 王一平.中国农业科学院 2013
[3]多糖类提取物及MF59佐剂对流感灭活疫苗免疫增强作用研究[D]. 谢国秀.湖南师范大学 2008
[4]PRRS蜂胶佐剂灭活疫苗的免疫效力研究[D]. 谢印乾.西北农林科技大学 2007
[5]黄芪多糖增强疫苗免疫效力及机理研究[D]. 高艳艳.中国农业科学院 2006
[6]乳酸杆菌肽聚糖免疫调节作用及其机制初探[D]. 苏广伟.江南大学 2006
本文编号：3564126
【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：99 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
大肠表达猪Gp96N的基因克隆（A)、SDS-PAGE(B)和Westerblot检测结果（C)
3.2.1 PCR扩増得到猪Gp96N基因以pET-32a/Gp96N为模板，经PCR扩增得到1002bp左右的片段（图2-2)，与预期相符，表明PCR扩增得到猪Gp%N基M(bp) 130(%■靈免,交■？f^r?- ^图2-2酵母菌表达猪Gp96N的基因克隆Fig.2-2 PCR product of Gp96N gene. M: DNA marker ； 1 :Gp96N gene3.2.2构建得到毕赤酵姆表达质粒pPICZaA/Gp96N将PCR扩增得到的猪Gp%N基闪片段勾载体pPICZaA用A7;o /和Xk//双酶切，纯化冋收酶切产物，WT4DNA连接酶反应1211构建重组表达质粒pPICZaA-Gp96N，转化人肠杆歯DH5a感受态细胞，获得重组歯。挑取重组歯单克隆，提取质粒，表达质粒pPICZaA-Gp%N经/和/双酶切后，电泳检测结果如图2-3所示
.15统计学分析釆用r检验法比较各组之W的差异，/^>0.05代表差兄显著；*尸<0.05代表差兄显著；**尸<0.01表差兄非常显著；***P<0.001代表差兄极显著。结果与分析.1 PRRSV的B细胞表位和T细胞表位的序列分析选样2条文献报道的能被PRRSV中和抗体识别的B细胞表位Gp4-59B和Gp5-37B，以及7条RRSV的T细胞抗原表位（表3-1)。然后，从GeneBank t下载了大量II哨PRRSV毒株的GP4(379）、GP5 (1001条）和N蛋(226条）序列，利用Weblogo软件对这些表位的氨基酸进行保守性析，结果如图3-1所示，除GP4-59B变兄性较大外，其他8条序列（GP5-37B、GP4-7T、GP4-170T、P5-149T、GP5-U7T、N-49T、N-63T和N-104T)均丨?分保守。利用DNAStar软件分析表位的抗原发现GP5-37B、GP4-7T和GP4-170T的抗原性较差，其他6条表位的抗原性均较商（图3-1)。因，报据保守性分析结果合成这些表位多肽。S % e T I N k I s (;p4-l70'^;< ■ ? * ? i ? t r i
【参考文献】：
期刊论文
[1]昆虫热激蛋白90的研究进展[J]. 张珂,翁群芳,付昊昊. 生物技术通报. 2014(02)
[2]热休克蛋白在肝细胞癌形成、增殖、复发、转移及抗肿瘤免疫中的作用研究[J]. 吴嘉仪,李高鹏,罗葆明. 岭南现代临床外科. 2013(04)
[3]IFN-α对gp96的上调降低其抗HBV的效率[J]. 郜衍周,范红霞,邱立鹏,孟颂东. 微生物学报. 2013(08)
[4]犬GM-CSF基因对犬细小病毒VP2DNA疫苗的免疫增强作用[J]. 贾启恒,温洁霞,王利月,林洪羽,张峰,王璐,孙岩,李秀锦,仲飞. 中国兽医学报. 2013(05)
[5]疫苗佐剂的研究现状和发展趋势[J]. 李娜,周伟芳,刘慧敏,李赞,仇华吉. 中国预防兽医学报. 2013(01)
[6]热激蛋白gp96免疫学功能及在主动免疫治疗肿瘤和传染病中的应用[J]. 徐亚星,王赛锋,张小俊,孟颂东. 生物工程学报. 2012(03)
[7]Gp96蛋白的免疫学及其临床应用研究进展[J]. 陈才伟,贾晓娟,孟颂东,刘文军. 生物工程学报. 2011(05)
[8]细菌脂多糖诱导巨噬细胞NO信号分子释放的研究进展[J]. 赵娟,刘扬,冯琳,周小秋. 黑龙江畜牧兽医. 2011(03)
[9]脂质体制剂在医疗中的应用现状[J]. 陆书华,杨兴光. 中国病原生物学杂志. 2010(12)
[10]IL-12及其免疫调节作用[J]. 孙敬,洪杰华,郑世民. 动物医学进展. 2010(02)
博士论文
[1]中链脂肪酸甘油三酯作为免疫佐剂的免疫效果的研究和应用[D]. 李丽杰.中国海洋大学 2013
硕士论文
[1]纳微球新型佐剂对HPV L1五聚体蛋白的包埋及其免疫效应的研究[D]. 贾成成.华南理工大学 2013
[2]细胞因子对PCV2-Cap蛋白免疫增强作用及Cap与FMDV-Vp1共表达产物免疫原性鉴定[D]. 王一平.中国农业科学院 2013
[3]多糖类提取物及MF59佐剂对流感灭活疫苗免疫增强作用研究[D]. 谢国秀.湖南师范大学 2008
[4]PRRS蜂胶佐剂灭活疫苗的免疫效力研究[D]. 谢印乾.西北农林科技大学 2007
[5]黄芪多糖增强疫苗免疫效力及机理研究[D]. 高艳艳.中国农业科学院 2006
[6]乳酸杆菌肽聚糖免疫调节作用及其机制初探[D]. 苏广伟.江南大学 2006
本文编号：3564126
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