利用同源重组技术构建Hoxa5、BMP6真核表达载体及共转染成纤维细胞表达

发布时间：2022-01-04 20:52

　　旨在利用同源重组构建敖汉细毛羊Hoxa5、BMP6基因表达载体及共转染成纤维细胞后通过基因表达量变化研究两基因之间的相互作用关系。以敖汉细毛羊为研究对象,采集30日龄的胎羊。首先,通过RNA的提取反转录成cDNA参照GenBank中Hoxa5、BMP6基因序列和pcDNA3.1序列分别设计1对含有同源臂的引物,通过PCR反应扩增获得Hoxa5、BMP6基因片段、利用SoSo试剂盒将目的片段连接到pcDNA3.1真核表达载体上。鉴定构建pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMP6重组表达载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的质粒pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMP6共转染至成纤维细胞,采用RT-PCR技术和Western Blot技术检测Hoxa5、BMP6基因单转染和共转染在成纤维细胞中表达量的变化。结果显示:经酶切、测序鉴定质粒pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMP6构建成功,并且共转染成纤维细胞Hoxa5基因的表达量极显著下降,BMP6基因的表达量极显著升高且共转染组的表达量极显著地高... 

【文章来源】：华北农学报. 2020,35(04)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

Hoxa5、BMP6基因 PCR扩增

使用Kpn Ⅰ将pcDNA3.1表达载体从环状酶切成链状,用1%琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切成功(图2)。1,2是对pcDNA3.1的Kpn Ⅰ单酶切,pcDNA3.1长度为5 428 bp,图中条带所在位置约是5 428 bp,结果显示酶切完成,回收条带进行重组。2.3 pcDNA3.1表达载体的重组及鉴定

将pcDNA3.1酶切成链状后,用SoSo试剂盒将BMP6、Hoxa5分别与pcDNA3.1相连接,转化,振荡培养,进行菌液PCR验证如图3所示,在约804 bp处有明亮电泳条带,是Hoxa5基因;537 bp处的是BMP6基因。菌液测序结果用Blast进行对比,结果如图4,说明BMP6、Hoxa5没有碱基的突变,已成功的连接到pcDNA3.1载体上。将连接好的重组载体从菌液中提取出来,如图5所示,1-2为pcDNA3.1-BMP6重组质粒,大小为5 965 bp,3-4为pcDNA3.1-Hoxa5重组质粒,大小为6 232 bp,与图中条带相符。2.4 细胞培养观察

【参考文献】：
期刊论文
[1]敖汉细毛羊BMP4基因质粒的构建及在成纤维细胞中表达量的研究[J]. 张梦瑶,杨峰,刘开东,刘积凤,柳楠,贺建宁,薛明.  华北农学报. 2019(06)
[2]敖汉细毛羊Hoxa5、BMPR1B基因互作研究[J]. 张梦瑶,杨峰,刘积凤,刘开东,贺建宁,柳楠.  华北农学报. 2019(02)
[3]敖汉细毛羊Notch1基因真核表达载体的构建及在成纤维细胞中表达量的研究[J]. 赵然然,张梦瑶,刘开东,王国义,刘积凤,柳楠,贺建宁.  畜牧与兽医. 2019(03)
[4]利用同源重组技术构建DKK1、BMP4真核表达载体及共转染成纤维细胞表达的研究[J]. 张梦瑶,杨峰,刘开东,刘积凤,贺建宁,柳楠.  华北农学报. 2018(05)
[5]敖汉细毛羊Hoxa5基因质粒的构建及在成纤维细胞中表达量的研究[J]. 张梦瑶,杨峰,刘开东,刘积凤,柳楠,贺建宁.  中国兽医杂志. 2018(10)
[6]利用同源重组构建敖汉细毛羊BMPR1B真核表达载体及在成纤维细胞中表达量的研究[J]. 张梦瑶,杨峰,刘开东,刘积凤,柳楠,贺建宁.  中国畜牧杂志. 2018(09)
[7]利用同源重组构建BMP6基因真核表达载体及在成纤维细胞中表达量的研究[J]. 张梦瑶,杨峰,刘开东,刘积凤,柳楠,贺建宁.  中国畜牧杂志. 2018(08)
[8]敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究[J]. 张梦瑶,杨峰,刘开东,程明,王国义,刘积凤,柳楠,贺建宁.  中国畜牧兽医. 2018(01)
[9]铁调素调节蛋白、骨形成蛋白6及铁调素在乳腺癌组织中的表达及其与贫血的关系[J]. 程旭,陆晔,李蓉,严敏,潘湘涛.  医学研究杂志. 2017(11)
[10]BMP6基因在单、双羔蒙古羊不同生理时期卵巢组织中的差异表达及分析[J]. 杨燕燕,杜文,刘永斌,达来,王标,青格勒,周璇,何亭漪,乌达巴拉,田瑛.  畜牧与饲料科学. 2017(03)



本文编号：3569038