pMGA1.2与ApoA-Ⅰ相互作用的功能结构域研究

发布时间：2022-01-07 20:19

　　鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum, MG）能够引起鸡的慢性呼吸道疾病（Chronic respiratory disease, CRD）,该病分布广泛,给世界各地养鸡业带来巨大的经济损失。研究表明,MG主要通过表面的黏附蛋白pMGA （Protein Mycoplasma Gallisepticum AdheA-In）与机体的受体结合而产生致病作用。课题组前期研究发现载脂蛋白ApoA-I是pMGA1.2的相互作用蛋白。本研究主要对pMGA1.2与ApoA-I相互作用的的功能结构域进行了研究,为进一步研究pMGA1.2与ApoA-I相互作用的的功能位点奠定了基础,主要研究成果如下：1.生物信息学预测pMGA1.2共有4个功能结构域,分别位于25-77位、105-166位氨基酸之间的两个FIVAR （Uncharacterised Sugar-binding Domain）结构域；位于171-596位氨基酸之间的Myco-haema （Mycoplasma haemagglutinin Domain）结构域,位于491-595位氨基酸之间的Galactose-b... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

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目录
摘要
ABSTRACT
縮略词表
1 文献综述
    1.1 鸡毒支原体的危害和防治
        1.1.1 鸡毒支原体的危害
        1.1.2 鸡毒支原体的防治
    1.2 pMGA1.2研究进展
    1.3 ApoA-I研究进展
    1.4 蛋白结构域
    1.5 研究的目的及意义
2 材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验样本
        2.1.2 主要仪器
        2.1.3 主要试剂及耗材
        2.1.4 主要溶液的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 生物信息学预测pMGA1.2的功能结构域
        2.2.2 pMGA1.2片段(1,2,3,4)的克隆
        2.2.3 pMGA1.2-N(N=1,2)原核表达质粒的构建
        2.2.4 KG-pMGA1.2-N(N=1,2)的诱导表达
        2.2.5 pMGA1.2-N(N=1,2)蛋白纯化
        2.2.6 表达产物的Western-blot检测
        2.2.7 病毒铺覆蛋白印迹(VOPBA)分析
        2.2.8 PG、PR、PG-AI、PR-AI菌液复苏
        2.2.9 PG、PR、PG-AI、PR-AI酶切分析
        2.2.10 pCDNA3.1-GFP/RFP-pMGA1.2-N(N=3,4)真核表达质粒的构建
        2.2.11 去内毒素质粒的制备
        2.2.12 细胞培养及质粒转染
        2.2.13 转染后细胞状态和融合蛋白的观察
        2.2.14 流式细胞仪检测蛋白表达量
3 结果与分析
    3.1 生物信息学预测pMGA1.2的功能结构域
    3.2 pMGA1.2-N(N=1,2,3,4)的克隆
        3.2.1 pMGA1.2-N(N=1,2,3,4)的扩增
        3.2.2 T-pMGA1.2-N(N=1,2,3,4)重组质粒的鉴定
    3.3 原核表达质粒KG-pMGA1.2-N(N=1,2)的构建
        3.3.1 原核表达质粒KG-pMGA1.2-N(N=1,2)的鉴定
    3.4 pMGA1.2-N(N=1,2)蛋白的诱导表达和纯化
        3.4.1 pMGA1.2-N(N=1,2)蛋白的诱导表达
        3.4.2 pMGA1.2-N(N=1,2)蛋白的纯化
    3.5 pMGA1.2-N(N=1,2)蛋白的免疫原性分析
        3.5.1 pMGA1.2-1蛋白的Western bolt检测
        3.5.2 pMGA1.2-2蛋白的Western bolt检测
    3.6 病毒铺覆蛋白印迹
        3.6.1 pMGA1.2-1的病毒铺覆蛋白印迹
        3.6.2 pMGA1.2-2的病毒铺覆蛋白印迹
    3.7 真核表达质粒的构建
        3.7.1 真核表达质粒PG,PR,PG-AI,PR-AI的鉴定
        3.7.2 真核表达质粒PG-3,PR-3的鉴定
        3.7.3 真核表达质粒PG-4,PR-4的鉴定
    3.8 真核表达质粒在Hela细胞中的表达
    3.9 流式细胞仪检测ApoA-I与pMGA1.2蛋白的表达量
4 讨论
    4.1 生物信息学预测功能结构域
    4.2 pMGA1.2-N(N=1,2,3,4)的克隆
    4.3 pMGA1.2-N(N=1,2)原核表达质粒的构建
    4.4 pMGA1.2-N(N=1,2)蛋白的诱导表达和纯化
    4.5 pMGA1.2-N(N=1,2)蛋白的免疫原性分析
    4.6 pMGA1.2-N(N=1,2)蛋白的病毒铺覆蛋白印迹
    4.7 真核表达质粒的构建
    4.8 流式细胞仪检测ApoA-I与pMGA1.2蛋白的表达量
5 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
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本文编号：3575204