猪流行性腹泻病毒遗传变异分析及诊断方法的建立

发布时间：2022-01-07 22:58

　　猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）引起的以严重的肠炎、呕吐和水样腹泻为特征的猪的一种急性肠道传染病，是危害我国养猪业主要疫病之一。1976年我国首次报道此病，2011年全国范围内再次爆发仔猪腹泻疫情，新生仔猪的发病率和死亡率极高，为了探究此次仔猪腹泻疫情的病因，了解病原的分子流行病学特点，主要开展了以下研究：在仔猪腹泻疫情流行期间，我们从浙江、福建等5个省、市不同地区的发病猪场采集了115份临床腹泻样品，通过RT-PCR方法检测结果显示PEDV阳性率高达81.7%，我们选取了部分阳性样品进行PEDV全长基因组和S、M、N、ORF3基因的克隆和测序，并进行序列比对和遗传演化分析。全长基因核苷酸序列比对结果显示，流行毒株ZJCZ4与参考株CHGD-01的同源性较高，达到99.1%，与经典代表株CV777的同源性为96.9%。主要结构蛋白氨基酸序列比对结果表明：流行毒株的S蛋白氨基酸发生变异较为明显，变异位点主要集中在S1区域。与参考株CV777相比，流行毒株的S1中... 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 病毒的发现
    1.2 病原学研究
        1.2.1 PEDV的分类地位
        1.2.2 PEDV的形态特征和理化性质
        1.2.3 PEDV的细胞培养特性
        1.2.4 PEDV的分子生物学特性
    1.3 病毒蛋白的研究
        1.3.1 S蛋白
        1.3.2 M蛋白
        1.3.3 N蛋白
        1.3.4 ORF3蛋白
    1.4 分子流行病学
        1.4.1 S基因
        1.4.2 M基因
        1.4.3 N基因
        1.4.4 ORF3基因
    1.5 实验室诊断方法
        1.5.1 RT-PCR方法
        1.5.2 免疫电镜法
        1.5.3 ELISA法
        1.5.4 免疫荧光法
        1.5.5 微量血清中和试验
        1.5.6 原位杂交技术
    1.6 疫苗研究进展
        1.6.1 灭活疫苗
        1.6.2 弱毒疫苗
        1.6.3 转基因植物疫苗
        1.6.4 乳酸杆菌疫苗
        1.6.5 亚单位疫苗
    1.7 研究目的与意义
第二章 猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析
    摘要
    2.1 材料与方法
        2.1.1 主要试剂
        2.1.2 病料采集及处理
        2.1.3 引物设计
        2.1.4 临床样品检测
        2.1.5 病毒基因的克隆及测序
        2.1.6 病毒基因组序列拼接分析
    2.2 结果
        2.2.1 临床腹泻样品RT-PCR检测
        2.2.2 序列测定结果
        2.2.3 ZJCZ4Blast分析结果
        2.2.4 ZJCZ4全长基因序列分析
        2.2.5 主要结构蛋白氨基酸序列比较
        2.2.6 ORF3基因分析
    2.3 讨论
第三章 猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立
    摘要
    3.1 材料与方法
        3.1.1 毒株与样品来源
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 引物设计
        3.1.4 样品中RNA提取及反转录
        3.1.5 鉴别诊断RT-PCR扩增及最佳Tm值的确定
        3.1.6 RT-PCR最佳引物浓度的确定
        3.1.7 特异性试验
        3.1.8 敏感性试验
        3.1.9 RT-PCR检测临床样品
    3.2 结果
        3.2.1 RT-PCR反应条件的优化
        3.2.2 RT-PCR特异性鉴定
        3.2.3 RT-PCR敏感性试验
        3.2.4 临床样品的检测
    3.3 讨论
第四章 猪流行性腹泻病毒N蛋白抗原性分析及单克隆抗体的制备
    摘要
    4.1 材料与方法
        4.1.1 菌种、载体和血清
        4.1.2 主要试剂和耗材
        4.1.3 引物设计
        4.1.4 N基因的扩增及克隆
        4.1.5 重组表达质粒的构建及鉴定
        4.1.6 重组质粒的诱导表达鉴定及纯化
        4.1.7 N蛋白抗原性分析
        4.1.8 抗N蛋白单克隆抗体的制备
        4.1.9 多克隆抗体的制备及效价测定
        4.1.10 单克隆抗体的初步应用
    4.2 结果
        4.2.1 N基因的扩增
        4.2.2 N基因重组表达质粒的鉴定
        4.2.3 重组N蛋白的表达
        4.2.4 N蛋白的纯化及westernblot分析
        4.2.5 间接ELISA方法的初步建立
        4.2.6 单克隆抗体的制备
        4.2.7 单克隆抗体的初步应用
    4.3 讨论
第五章 全文总结
参考文献
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒重组腺病毒疫苗的构建及小鼠免疫试验[J]. 焦茂兴,吴锋,刘德辉,黄毓茂.  中国畜牧兽医. 2012(02)
[2]表达猪流行性腹泻病毒中和抗原位点的重组干酪乳杆菌免疫小鼠诱导的免疫应答[J]. 葛俊伟,姜艳平,汪淼,乔薪瑗,刘敏,唐丽杰,李一经.  中国兽医科学. 2010(07)
[3]表面表达猪流行性腹泻病毒核蛋白蛋白的重组干酪乳杆菌诱导产生的免疫应答[J]. 葛俊伟,姜艳平,汪淼,乔薪瑗,刘敏,唐丽杰,李一经.  生物工程学报. 2009(06)
[4]猪流行性腹泻病毒分子生物学研究进展[J]. 孙东波,冯力,时洪艳,陈建飞.  动物医学进展. 2006(10)
[5]猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白抗原间接ELISA抗体检测方法的建立[J]. 孙东波,冯力,时洪艳,刘胜旺,陈洪岩,佟有恩,李伟杰,王明,马思奇,陈建飞.  中国预防兽医学报. 2006(05)
[6]猪流行性腹泻与猪传染性胃肠炎二联油乳剂灭活疫苗的田间免疫试验[J]. 还红华,何孔旺,倪艳秀,林继煌,华国浩,梁晓辉.  中国兽医杂志. 2002(06)
[7]猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎弱毒二联疫苗研究[J]. 李树根,周仲芳,李力复,林志雄,童昆周,罗长保,颜思通,陈茹.  中国兽医杂志. 2000(08)
[8]猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻二联弱毒疫苗的研究[J]. 佟有恩,冯力,李伟杰,朱远茂,王明,马思奇.  中国预防兽医学报. 1999(06)
[9]应用直接免疫荧光法检测猪流行性腹泻病毒的研究[J]. 林志雄,黄引贤,李树根,李力复,童昆周.  中国进出境动植检. 1997(02)
[10]猪流行性腹泻微量血清中和试验的建立和应用[J]. 林志雄,季树根,李力复,陈茹,童昆周.  中国兽医科技. 1994(11)

硕士论文
[1]猪传染性胃肠炎和流行性腹泻二联核酸疫苗免疫效力研究[D]. 孟凡丹.东北农业大学 2011



本文编号：3575429