东方巴贝斯虫热休克蛋白20基因克隆表达及功能研究
发布时间：2022-01-08 10:54
东方巴贝斯虫（Babesia orientalis）是寄生于水牛的一种重要的血液原虫,以镰形扇头蜱（Rhipicephalus haemaphysaloides）为传播媒介,临床症状为高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等,严重时导致水牛死亡。东方巴贝斯虫病在我国南方许多省份发生和流行,造成严重经济危害。本实验室通过对东方巴贝斯虫的形态学、生活史、传播媒介和分子分类学等多方面详细研究,确立B. orientalis为一新种。近年来,本实验室致力于B.orientalis分子生物学研究,对东方巴贝斯虫进行了全基因组测序,为研究B.orientalis的功能基因提供了重要途径。小分子热休克蛋白（small heat shock proteins, sHSPs）是分子量大小在12-43kDa,具有保守的约80～100氨基酸组成的α晶状体蛋白结构域的一类热休克蛋白亚家族。sHSPs与寄生虫感染具有重要的关系,其中小分子热休克蛋白HSP20影响顶复门寄生虫的移行和入侵等过程。巴贝斯虫的HSP20蛋白非常保守,是一种重要的虫体抗原,能够引起特异性T细胞的免疫应答。本研究通过比对基因组信息,找出东方巴贝斯虫...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 文献综述
1.1 研究背景
1.2 小分子热休克蛋白研究进展
1.2.1 小分子热休克蛋白的概述
1.2.2 小分子热休克蛋白的生物学作用
1.2.3 小分子热休克蛋白的结构特点及与功能的关系
1.2.4 小分子热休克蛋白与寄生虫感染
2 研究目的与意义
3 材料与方法
3.1 试验材料
3.1.1 虫株、血清和试验动物
3.1.2 质粒和菌株
3.1.3 酶和主要试剂
3.1.4 抗生素和培养基的配制
3.1.5 主要溶液的配制
3.1.6 仪器和设备
3.2 试验方法
3.2.1 生物信息学分析方法和工具
3.2.2 引物的设计
3.2.3 东方巴贝斯虫基因组DNA的提取
3.2.4 东方巴贝斯虫HSP20基因的扩增和克隆测序
3.2.5 系统进化分析
3.2.6 东方巴贝斯虫总RNA的提取
3.2.7 RT-PCR扩增东方巴贝斯虫HSP20基因的ORF
3.2.8 重组表达质粒的构建
3.2.9 东方巴贝斯虫HSP20蛋白表达
3.2.10 表达产物的大量提取和纯化
3.2.11 Western blot试验
3.2.12 ELISA检测实验牛血清抗体水平
3.2.13 多抗血清的制备和间接免疫荧光试验
3.2.14 大肠杆菌存活率实验
3.2.15 HSP20蛋白对BSA化学变性保护作用的测定
4 结果与分析
4.1 东方巴贝斯虫HSP20基因的克隆及分析
4.1.1 HSP20基因的PCR扩增
4.1.2 HSP20基因序列的测定
4.1.3 HSP20基因内含子的确定
4.1.4 HSP20序列的比对和分子进化分析
4.1.5 HSP20序列的生物信息学分析
4.2 东方巴贝斯虫HSP20蛋白的表达、纯化及抗原性
4.2.1 HSP20基因ORF的扩增
4.2.2 重组质粒pMD19-T-BoHSP20的构建和酶切鉴定
4.2.3 重组质粒pET-28a-BoHSP20的构建和酶切鉴定
4.2.4 HSP20蛋白的诱导表达
4.2.5 表达产物存在形式
4.2.6 表达条件的优化
4.2.7 HSP20蛋白的纯化及抗原性分析
4.3 东方巴贝斯虫HSP20的免疫原性分析
4.3.1 东方巴贝斯虫的免疫荧光定位
4.3.2 牛血清抗体水平检测
4.4 东方巴贝斯虫HSP20分子伴侣活性检测
4.4.1 HSP20的表达对大肠杆菌存活率的影响
4.4.2 HSP20对BSA化学变性的保护作用
5 讨论
5.1 东方巴贝斯虫HSP20基因克隆及序列分析
5.2 东方巴贝斯虫HSP20蛋白的表达和功能验证
6 结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]新疆牛双芽巴贝斯虫病的流行病学调查[J]. 简子健,马素贞,孙其喆,沈炯玉,吕伟,苗中秋. 中国兽医学报. 2012(02)
[2]牛双芽巴贝斯虫GST-HSP20（exon）融合蛋白间接ELISA检测方法的建立[J]. 简子健,马素贞,孙其喆,沈炯玉,苗中秋,吕伟. 新疆农业科学. 2010(05)
[3]东方巴贝斯虫分泌性抗原的免疫保护作用研究[J]. 赵俊龙,刘钟灵,姚宝安,马丽华,刘恩勇,丁明星,张德明,任宪武,彭伏虎,钟龙群. 畜牧兽医学报. 2000(02)
[4]巴贝斯虫病水牛血清钙镁浓度变化与染虫率的关系[J]. 赵俊龙,尹绪军,刘钟灵. 中国动物检疫. 1997(04)
[5]寄生于中国水牛Bubalus Vbubalis的巴贝斯虫一新种（梨形虫目:巴贝斯科）[J]. 刘钟灵,赵俊龙,马丽华,姚宝安. 畜牧兽医学报. 1997(01)
[6]巴贝斯虫及其传播媒介——蜱的研究概况[J]. 陈启军,李德昌. 黑龙江畜牧兽医. 1995(11)
[7]应用镰形扇头蜱及巴贝斯虫病水牛的染虫血感染黄牛试验[J]. 刘钟灵,马丽华,姚宝安,赵俊龙. 畜牧兽医学报. 1995(05)
[8]水牛牛巴贝斯虫体外培养的研究Ⅱ．冷冻血清的应用和筛选[J]. 赵俊龙,姚宝安,马丽华,刘钟灵. 中国兽医学报. 1994(02)
[9]湖北省水牛巴贝斯焦虫病调查研究[J]. 刘钟灵,张光第,马丽华,黄继荪,陈新阶,高新山,杨待建. 畜牧兽医学报. 1986(01)
博士论文
[1]东方巴贝斯虫新型诊断方法的建立和基因组序列测定与分析[D]. 贺兰.华中农业大学 2011
[2]东方巴贝斯虫免疫相关蛋白的基因克隆及功能研究[D]. 周丹娜.华中农业大学 2009
[3]东方巴贝斯虫cDNA文库构建及其应用[D]. 刘琴.华中农业大学 2007
硕士论文
[1]牛双芽巴贝斯虫HSP20基因的克隆表达及其重组蛋白的免疫反应性研究[D]. 孙其喆.新疆农业大学 2009
本文编号：3576427
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 文献综述
1.1 研究背景
1.2 小分子热休克蛋白研究进展
1.2.1 小分子热休克蛋白的概述
1.2.2 小分子热休克蛋白的生物学作用
1.2.3 小分子热休克蛋白的结构特点及与功能的关系
1.2.4 小分子热休克蛋白与寄生虫感染
2 研究目的与意义
3 材料与方法
3.1 试验材料
3.1.1 虫株、血清和试验动物
3.1.2 质粒和菌株
3.1.3 酶和主要试剂
3.1.4 抗生素和培养基的配制
3.1.5 主要溶液的配制
3.1.6 仪器和设备
3.2 试验方法
3.2.1 生物信息学分析方法和工具
3.2.2 引物的设计
3.2.3 东方巴贝斯虫基因组DNA的提取
3.2.4 东方巴贝斯虫HSP20基因的扩增和克隆测序
3.2.5 系统进化分析
3.2.6 东方巴贝斯虫总RNA的提取
3.2.7 RT-PCR扩增东方巴贝斯虫HSP20基因的ORF
3.2.8 重组表达质粒的构建
3.2.9 东方巴贝斯虫HSP20蛋白表达
3.2.10 表达产物的大量提取和纯化
3.2.11 Western blot试验
3.2.12 ELISA检测实验牛血清抗体水平
3.2.13 多抗血清的制备和间接免疫荧光试验
3.2.14 大肠杆菌存活率实验
3.2.15 HSP20蛋白对BSA化学变性保护作用的测定
4 结果与分析
4.1 东方巴贝斯虫HSP20基因的克隆及分析
4.1.1 HSP20基因的PCR扩增
4.1.2 HSP20基因序列的测定
4.1.3 HSP20基因内含子的确定
4.1.4 HSP20序列的比对和分子进化分析
4.1.5 HSP20序列的生物信息学分析
4.2 东方巴贝斯虫HSP20蛋白的表达、纯化及抗原性
4.2.1 HSP20基因ORF的扩增
4.2.2 重组质粒pMD19-T-BoHSP20的构建和酶切鉴定
4.2.3 重组质粒pET-28a-BoHSP20的构建和酶切鉴定
4.2.4 HSP20蛋白的诱导表达
4.2.5 表达产物存在形式
4.2.6 表达条件的优化
4.2.7 HSP20蛋白的纯化及抗原性分析
4.3 东方巴贝斯虫HSP20的免疫原性分析
4.3.1 东方巴贝斯虫的免疫荧光定位
4.3.2 牛血清抗体水平检测
4.4 东方巴贝斯虫HSP20分子伴侣活性检测
4.4.1 HSP20的表达对大肠杆菌存活率的影响
4.4.2 HSP20对BSA化学变性的保护作用
5 讨论
5.1 东方巴贝斯虫HSP20基因克隆及序列分析
5.2 东方巴贝斯虫HSP20蛋白的表达和功能验证
6 结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]新疆牛双芽巴贝斯虫病的流行病学调查[J]. 简子健,马素贞,孙其喆,沈炯玉,吕伟,苗中秋. 中国兽医学报. 2012(02)
[2]牛双芽巴贝斯虫GST-HSP20（exon）融合蛋白间接ELISA检测方法的建立[J]. 简子健,马素贞,孙其喆,沈炯玉,苗中秋,吕伟. 新疆农业科学. 2010(05)
[3]东方巴贝斯虫分泌性抗原的免疫保护作用研究[J]. 赵俊龙,刘钟灵,姚宝安,马丽华,刘恩勇,丁明星,张德明,任宪武,彭伏虎,钟龙群. 畜牧兽医学报. 2000(02)
[4]巴贝斯虫病水牛血清钙镁浓度变化与染虫率的关系[J]. 赵俊龙,尹绪军,刘钟灵. 中国动物检疫. 1997(04)
[5]寄生于中国水牛Bubalus Vbubalis的巴贝斯虫一新种（梨形虫目:巴贝斯科）[J]. 刘钟灵,赵俊龙,马丽华,姚宝安. 畜牧兽医学报. 1997(01)
[6]巴贝斯虫及其传播媒介——蜱的研究概况[J]. 陈启军,李德昌. 黑龙江畜牧兽医. 1995(11)
[7]应用镰形扇头蜱及巴贝斯虫病水牛的染虫血感染黄牛试验[J]. 刘钟灵,马丽华,姚宝安,赵俊龙. 畜牧兽医学报. 1995(05)
[8]水牛牛巴贝斯虫体外培养的研究Ⅱ．冷冻血清的应用和筛选[J]. 赵俊龙,姚宝安,马丽华,刘钟灵. 中国兽医学报. 1994(02)
[9]湖北省水牛巴贝斯焦虫病调查研究[J]. 刘钟灵,张光第,马丽华,黄继荪,陈新阶,高新山,杨待建. 畜牧兽医学报. 1986(01)
博士论文
[1]东方巴贝斯虫新型诊断方法的建立和基因组序列测定与分析[D]. 贺兰.华中农业大学 2011
[2]东方巴贝斯虫免疫相关蛋白的基因克隆及功能研究[D]. 周丹娜.华中农业大学 2009
[3]东方巴贝斯虫cDNA文库构建及其应用[D]. 刘琴.华中农业大学 2007
硕士论文
[1]牛双芽巴贝斯虫HSP20基因的克隆表达及其重组蛋白的免疫反应性研究[D]. 孙其喆.新疆农业大学 2009
本文编号：3576427
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