报告型重组寨卡病毒的构建及在抗病毒药物筛选中的应用
发布时间：2022-01-08 11:14
寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）是一种重要蚊媒传播的人兽共患病病原,人、灵长类以及兔和猪对其易感,其感染宿主后能引起寨卡热,大多数感染者并没有明显症状或者症状较为轻微,但若在妊娠期间发生ZIKV感染,则可能导致新生儿出生缺陷,同时还可能造成妊娠者发生流产和早产等严重症状。目前,ZIKV在全球范围内呈蔓延趋势,我国虽无相关重大疫情的报道,但有相关研究显示,新生仔猪对于ZIKV易感,这使我国生猪养殖业面临着重大经济损失的风险。ZIKV在全球范围内尚无特异性治疗药物,亦无人用ZIKV疫苗,因此,开展ZIKV相关防控研究迫在眉睫。本研究根据GenBank公布的ZIKV（FSS13025株）基因编码序列以及密码子优化技术,将ZIKV C、prM和E蛋白基因分别克隆到pMAL-c5x载体中,构建pMAL-c5x-ZIKV-C、pMAL-c5x-ZIKV-prM和pMAL-c5x-ZIKV-E原核表达质粒。将上述三种质粒分别转化至E.coli ER2523感受态细胞,经扩大培养至OD600为0.60.8时,加入终浓度为1.0 mM IPTG后继续...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
ZIKV的基因组结构蛋白及多聚蛋白加工示意图(Kopsidaetal.,2017)
子元件(Foecking and Hofstetter, 1986; Thomsen et al., 1984)，其在真核细胞中通过直接转染病毒全长 cDNA 后便可以产生病毒 RNA。Pierson 等已成功将其用于 WNV 的“感染性 DNA”的构建(Pierson et al., 2005)。通过反向遗传技术来构建 ZIKV 主要有以下三种策略：（1）转染感染性 RNA 于易感细胞（ZIKV 全长基因组 cDNA 的转录产物）；（2）直接转染 DNA 质粒于易感细胞产生感染性 ZIKV；（3）将所有 ZIKV cDNA 片段共转染到易感细胞中，然后利用同源重组方式在转染细胞内通过自组装全长 ZIKV cDNA 以拯救完整病毒(Avila-Perez et al., 2018)。基于核酶的自我剪切策略，Zhong-Yu Liu 等克隆了其实验室于 2016 年分离的 ZIKV 的 cDNA 片段并成功组装了全长 cDNA，该 ZIKV cDNA 在 E 和 NS1 基因之间的连接处附近插入具有修饰作用的 II 组自剪接内含子P.li.LSUI2，其主要作用为保证 ZIKV cDNA 的稳定性并且可通过体外剪接反应从 RNA 转录物中除去，该 ZIKV cDNA 克隆转录的 RNA 产物转染到 BHK-21 细胞中能够产生感染性子代病毒(Liuet al., 2017)。James Weger-Lucarelli 等利用第二种策略构建了两种质粒感染性克隆系统，并拯救了能在人和蚊子细胞中复制的感染性病毒(Weger-Lucarelli et al., 2017)。Gadea 等开发了一种可以快速构建报告型 ZIKV 的克隆方法：将 eGFP 基因插入到 ZIKV C 蛋白 N 端第 33 个氨基酸后，同时在引入四个重叠的全长基因组 RNA 序列的重叠合成片段，将病毒 RNA 基因组直接电转到 Vero细胞中，这种策略能够产生表达 GFP 报告基因的重组 ZIKV（图 1-2）(Gadea et al., 2016)。
国农业科学院硕士学位论文 第二章 寨卡病毒结构蛋白基因的原核表达及多克隆抗体的制12~16 h后，按1:100比例接种于100 ml LB培养基中至OD600为0.6～0.8，加入终浓度为1.0 mPTG 后继续震荡培养 4 h。将诱导菌液离心经超声破碎后，分别取上清和沉淀进行 SDS-PAGE鉴定 ZIKV C、prM 和 E 结构蛋白的表达情况，结果显示：诱导表达的 ZIKV C、prM 和 E 结白与未诱导菌株相比较发现其分别在 55 kDa，60 kDa 和 100 kDa 大小左右出现粗状目的条带明 ZIKV C、prM 和 E 基因蛋白能够准确表达，与预期一致（图 2-2）。
本文编号：3576454
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
ZIKV的基因组结构蛋白及多聚蛋白加工示意图(Kopsidaetal.,2017)
子元件(Foecking and Hofstetter, 1986; Thomsen et al., 1984)，其在真核细胞中通过直接转染病毒全长 cDNA 后便可以产生病毒 RNA。Pierson 等已成功将其用于 WNV 的“感染性 DNA”的构建(Pierson et al., 2005)。通过反向遗传技术来构建 ZIKV 主要有以下三种策略：（1）转染感染性 RNA 于易感细胞（ZIKV 全长基因组 cDNA 的转录产物）；（2）直接转染 DNA 质粒于易感细胞产生感染性 ZIKV；（3）将所有 ZIKV cDNA 片段共转染到易感细胞中，然后利用同源重组方式在转染细胞内通过自组装全长 ZIKV cDNA 以拯救完整病毒(Avila-Perez et al., 2018)。基于核酶的自我剪切策略，Zhong-Yu Liu 等克隆了其实验室于 2016 年分离的 ZIKV 的 cDNA 片段并成功组装了全长 cDNA，该 ZIKV cDNA 在 E 和 NS1 基因之间的连接处附近插入具有修饰作用的 II 组自剪接内含子P.li.LSUI2，其主要作用为保证 ZIKV cDNA 的稳定性并且可通过体外剪接反应从 RNA 转录物中除去，该 ZIKV cDNA 克隆转录的 RNA 产物转染到 BHK-21 细胞中能够产生感染性子代病毒(Liuet al., 2017)。James Weger-Lucarelli 等利用第二种策略构建了两种质粒感染性克隆系统，并拯救了能在人和蚊子细胞中复制的感染性病毒(Weger-Lucarelli et al., 2017)。Gadea 等开发了一种可以快速构建报告型 ZIKV 的克隆方法：将 eGFP 基因插入到 ZIKV C 蛋白 N 端第 33 个氨基酸后，同时在引入四个重叠的全长基因组 RNA 序列的重叠合成片段，将病毒 RNA 基因组直接电转到 Vero细胞中，这种策略能够产生表达 GFP 报告基因的重组 ZIKV（图 1-2）(Gadea et al., 2016)。
国农业科学院硕士学位论文 第二章 寨卡病毒结构蛋白基因的原核表达及多克隆抗体的制12~16 h后，按1:100比例接种于100 ml LB培养基中至OD600为0.6～0.8，加入终浓度为1.0 mPTG 后继续震荡培养 4 h。将诱导菌液离心经超声破碎后，分别取上清和沉淀进行 SDS-PAGE鉴定 ZIKV C、prM 和 E 结构蛋白的表达情况，结果显示：诱导表达的 ZIKV C、prM 和 E 结白与未诱导菌株相比较发现其分别在 55 kDa，60 kDa 和 100 kDa 大小左右出现粗状目的条带明 ZIKV C、prM 和 E 基因蛋白能够准确表达，与预期一致（图 2-2）。
本文编号：3576454
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