牛诺如病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立
发布时间：2022-01-15 01:37
牛诺如病毒（BNoV）是国内新发的犊牛腹泻的病原,为建立高效快速、特异的BNoV定量检测方法,本研究参照GenBank登录的BNoV的RdRp基因的保守序列,设计合成了1对特异性引物和1条探针,通过优化反应条件和体系,建立了BNoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,该方法选择的引物具有高度特异性,只对BNoV有特异性扩增,而对牛冠状病毒等4种犊牛腹泻常见病原未见扩增;对BNoV核酸最低检测限为15.9 copies/μL,且批内、批间变异系数均小于2%,重复性好。对采集自2017年9月至2019年11月河南、山东和四川省的261份犊牛腹泻样本进行检测,结果显示BNoV的阳性检出率为11.49%（30/261）。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法对BNoV的病原检测和流行病学调查具有重要意义。
【文章来源】：中国兽医科学. 2020,50(08)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
BNoV目的基因片段的PCR扩增Figure1PCRamplificationofthetargetfragmentofBNoV100bp
法检出的所有阳性样品。其中河南、四川省的样本中BNoV检出率分别为11.31％和25％，山东省的样本中未检出BNoV。3讨论BNoV是犊牛腹泻的主要病原之一，鉴于BNoV尚无成熟的分离培养体系，目前尚无有效的疫苗对其进行有效防疫。且BNoV与其他犊牛腹泻病原如BCoV、BRoV和BVDV等混合感染时，会加重犊牛腹泻病的程度［15］。因此，早期检测和及时净化病原是防控BNoV的重点。目前检测BNoV的方法主要有电镜观察、抗原抗体ELISA检测［16］、病毒分离、RT-PCR和实时荧光定量PCR等。观察电镜时需要较多的病毒粒子，且图2荧光定量PCR方法的熔解曲线Figure2Meltingcurveofreal-timePCRforBNoV1：重组质粒；2：阴性对照。1：pMD18T-BNoV-RdRp；2：Negativecontrol.760.241888.530572.819479.109385.398291.687197.977104.26610.555-83.155-d（Rn）/dT60626466687072747678808284868890温度／℃Temperature12图3荧光定量PCR方法的标准曲线Figure3Standardcurveofthereal-timePCR35.3232.7730.2227.8725.1222.5720.0217.4614.9112.36Ct1.02.03.04.05.06.07.08.09.0起始拷贝数的对数值logstartingquantity，copynumbery＝-3.19x+41.064，R2＝0.999图4荧光定量PCR的特异性检测Figure4Specificitytestofthereal-timePCR1：重组质粒pMD18T-BNoV-RdRp，1.59×106copies／L；2～6：分别为BCoV、BRoV、BVDV、BAstV和ddH2O。1：pMD18T-BNoV-RdRp，1.59×106copies／L；2—6：BCoV，BRoV，BVDV，BAstVandddH2O，respectively.1.246601.087260.927920.768590.609250.449910.290570.13123-0.02810-0.18744Rn13579111315171921232527293
凳庇?舛?縋CR条件优化及标准曲线的建立通过对引物浓度和探针浓度的优化，最终确定荧光定量PCR反应体系：总体积为20L，其中2×Premix10L，BNoV-F/BNoV-R引物（10mol/L）各0.6L，BNoV-P探针（10mol/L）0.3L，模板2L，ddH2O6.5L。反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃34s，共40个循环，每个循环结束时收集荧光信号。将BNoV重组质粒依次进行10倍倍比稀释后，依照优化后的反应体系及条件，对不同拷贝数的重组质粒进行扩增。结果显示，重组质粒在1.59×102copies／L～1.59×108copies／L之间线性关系良好（图3），回归方程为y＝－3.19x＋41.064，相关系数R2＝0.999。2.4荧光定量PCR的特异性分析利用本研究建立的荧光定量PCR方法分别对BCoV、BRoV、BVDV和BAstV的cDNA及重组质粒pMD18T-BNoV-RdRp进行检测。结果显示，该方法仅对重组质粒有扩增，其他病原及阴性对照均无特异性扩增（图4）。2.5荧光定量PCR的敏感性分析将重组质粒pMD18T-BNoV-RdRp进行10倍倍比稀释后作为模板，利用优化后的荧光定量PCR进行扩增。敏感性试验结果显示，该方法所能检出的最低BNoV标准品拷贝数为15.9copies/L（图5A），而常规PCR最低检出BNoV的拷贝数为1.59×104copies/L（图5B）。表明该荧光定量PCR方法敏感性更高。2.6荧光定量PCR的重复性分析以4个稀释度的重组质粒为模板分别进行批内和批间重复性试验。结果显示，批内、批间的变异系数均小于2.0％（表2）。表明该方法具有良好的重复性。2.7临床样品的检测两种检测方法对BNoV的检出结果见表3。其中TaqMan荧光定量PCR方法检出BNoV的样品数为30份，BNoV阳性率为11.49％，且该方法检出的阳性样品包含RT-PCR方法检出的所有阳性样品。其中河南、四川省的样本中BNoV检出率分别
本文编号：3589634
【文章来源】：中国兽医科学. 2020,50(08)北大核心CSCD
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【部分图文】：
BNoV目的基因片段的PCR扩增Figure1PCRamplificationofthetargetfragmentofBNoV100bp
法检出的所有阳性样品。其中河南、四川省的样本中BNoV检出率分别为11.31％和25％，山东省的样本中未检出BNoV。3讨论BNoV是犊牛腹泻的主要病原之一，鉴于BNoV尚无成熟的分离培养体系，目前尚无有效的疫苗对其进行有效防疫。且BNoV与其他犊牛腹泻病原如BCoV、BRoV和BVDV等混合感染时，会加重犊牛腹泻病的程度［15］。因此，早期检测和及时净化病原是防控BNoV的重点。目前检测BNoV的方法主要有电镜观察、抗原抗体ELISA检测［16］、病毒分离、RT-PCR和实时荧光定量PCR等。观察电镜时需要较多的病毒粒子，且图2荧光定量PCR方法的熔解曲线Figure2Meltingcurveofreal-timePCRforBNoV1：重组质粒；2：阴性对照。1：pMD18T-BNoV-RdRp；2：Negativecontrol.760.241888.530572.819479.109385.398291.687197.977104.26610.555-83.155-d（Rn）/dT60626466687072747678808284868890温度／℃Temperature12图3荧光定量PCR方法的标准曲线Figure3Standardcurveofthereal-timePCR35.3232.7730.2227.8725.1222.5720.0217.4614.9112.36Ct1.02.03.04.05.06.07.08.09.0起始拷贝数的对数值logstartingquantity，copynumbery＝-3.19x+41.064，R2＝0.999图4荧光定量PCR的特异性检测Figure4Specificitytestofthereal-timePCR1：重组质粒pMD18T-BNoV-RdRp，1.59×106copies／L；2～6：分别为BCoV、BRoV、BVDV、BAstV和ddH2O。1：pMD18T-BNoV-RdRp，1.59×106copies／L；2—6：BCoV，BRoV，BVDV，BAstVandddH2O，respectively.1.246601.087260.927920.768590.609250.449910.290570.13123-0.02810-0.18744Rn13579111315171921232527293
凳庇?舛?縋CR条件优化及标准曲线的建立通过对引物浓度和探针浓度的优化，最终确定荧光定量PCR反应体系：总体积为20L，其中2×Premix10L，BNoV-F/BNoV-R引物（10mol/L）各0.6L，BNoV-P探针（10mol/L）0.3L，模板2L，ddH2O6.5L。反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃34s，共40个循环，每个循环结束时收集荧光信号。将BNoV重组质粒依次进行10倍倍比稀释后，依照优化后的反应体系及条件，对不同拷贝数的重组质粒进行扩增。结果显示，重组质粒在1.59×102copies／L～1.59×108copies／L之间线性关系良好（图3），回归方程为y＝－3.19x＋41.064，相关系数R2＝0.999。2.4荧光定量PCR的特异性分析利用本研究建立的荧光定量PCR方法分别对BCoV、BRoV、BVDV和BAstV的cDNA及重组质粒pMD18T-BNoV-RdRp进行检测。结果显示，该方法仅对重组质粒有扩增，其他病原及阴性对照均无特异性扩增（图4）。2.5荧光定量PCR的敏感性分析将重组质粒pMD18T-BNoV-RdRp进行10倍倍比稀释后作为模板，利用优化后的荧光定量PCR进行扩增。敏感性试验结果显示，该方法所能检出的最低BNoV标准品拷贝数为15.9copies/L（图5A），而常规PCR最低检出BNoV的拷贝数为1.59×104copies/L（图5B）。表明该荧光定量PCR方法敏感性更高。2.6荧光定量PCR的重复性分析以4个稀释度的重组质粒为模板分别进行批内和批间重复性试验。结果显示，批内、批间的变异系数均小于2.0％（表2）。表明该方法具有良好的重复性。2.7临床样品的检测两种检测方法对BNoV的检出结果见表3。其中TaqMan荧光定量PCR方法检出BNoV的样品数为30份，BNoV阳性率为11.49％，且该方法检出的阳性样品包含RT-PCR方法检出的所有阳性样品。其中河南、四川省的样本中BNoV检出率分别
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