猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆与表达及其免疫原性研究
发布时间：2022-01-16 01:39
猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2, PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原,而且还与猪皮炎与肾炎综合症（PDNS）、猪先天性脑震颤（CT-AII）、增生性坏死性肺炎（PNP）等疾病的发生有一定的关联。该病毒感染猪体后能够导致机体免疫功能抑制,并且容易诱发双重或多重感染,使病情复杂化,严重影响了养猪业的健康发展。PCV2含有两个主要的开放阅读框（Open reading frame, ORF）,其中ORF2基因编码的核衣壳（Cap）蛋白,是病毒主要的结构蛋白,可以刺激机体产生一定的免疫保护反应,并且PCV1与PCV2的Cap蛋白氨基酸的同源性比较低,两者之间不存在血清交叉性反应。因此Cap蛋白在血清学诊断及基因工程亚单位疫苗研究中具有重要意义。本研究分别利用原核表达系统和杆状病毒表达载体系统（BEVS）对PCV2 Cap蛋白进行表达,并对其进行免疫原性分析。首先,进行了PCV2 Cap蛋白在大肠杆菌——原核系统表达的研究。根据GenBank中公布的PCV2 WH株（FJ598044） ORF2基因序列设计一对引物,以PCV2 WH...
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
主要符号列表
文献综述
引言
1 材料与方法
1.1 实验菌株、质粒和血清
1.2 酶类与主要试剂(盒)
1.3 主要培养基与溶液的配置
1.4 实验动物及细胞株
1.5 主要仪器
1.6 PCV2 WH株去信号肽ORF2基因的原核表达及其抗体的制备
1.6.1 引物的设计与合成
1.6.2 病毒DNA的提取及目的基因的获得
1.6.3 目的基因与表达载体的连接
1.6.4 重组Cap蛋白的诱导表达及分析
1.6.5 重组Cap蛋白的纯化
1.6.6 重组Cap蛋白的Western blotting鉴定
1.6.7 重组Cap蛋白的浓度测定
1.6.8 抗重组Cap蛋白血清的制备
1.6.9 PCV2 WH株感染PK-15细胞的检测
1.7 PCV2 ORF2基因在昆虫细胞中的表达
1.7.1 杆状病毒转移载体的构建
1.7.2 重组穿梭载体rBacmid-Cap2的构建
1.7.3 重组杆状病毒的获得与病毒扩增
1.7.4 重组Cap蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达及鉴定
1.7.5 病毒的滴度测定
1.7.6 重组Cap蛋白表达条件的优化
1.8 重组Cap蛋白免疫小鼠实验
1.8.1 样品的处理及实验动物分组
1.8.2 对免疫小鼠血清抗体动态监测
1.8.3 免疫小鼠血清抗体中和活性的分析
2 结果与分析
2.1 PCV2 WH株去信号肽ORF2基因的原核表达及其抗体的制备
2.1.1 目的基因的扩增
2.1.2 表达重组质粒pET-32a-cap2的鉴定
2.1.3 重组Cap蛋白的诱导表达、可溶性分析及纯化
2.1.4 重组Cap蛋白的浓度测定
2.1.5 PCV2 WH株感染PK-15细胞的检测
2.2 PCV2 ORF2优化基因在昆虫细胞中的表达
2.2.1 重组转移载体pFastBac~(TM)HTA-cap2的鉴定
2.2.2 重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-cap2的鉴定
2.2.3 重组杆状病毒的获得及鉴定
2.2.4 Western blotting分析重组Cap蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达
2.2.5 间接免疫荧光(IFA)检测目的蛋白的表达
2.2.6 病毒滴度的测定
2.2.7 重组Cap蛋白表达条件的优化
2.3 重组Cap蛋白免疫小鼠实验
2.3.1 免疫小鼠血清抗体动态监测分析
2.3.2 免疫小鼠血清中和效价的测定
3 讨论
3.1 PCV2 WH株ORF2基因的序列分析及其原核表达
3.2 杆状病毒表达系统的选择
3.3 核衣壳蛋白Cap在Sf9昆虫表达及影响其表达的因素
3.4 重组Cap蛋白免疫小鼠试验
4 结论
参考文献
附录
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立[J]. 申世川,王一成,袁秀芳,徐丽华,李军星. 浙江农业学报. 2013(01)
[2]猪圆环病毒2型Rep和Rep’蛋白免疫原性及其抗体中和活性的测定[J]. 刘丹,王一平,危艳武,唐青海,吴洪丽,刘建波,李胜斌,魏萍,刘长明. 中国兽医科学. 2012(12)
[3]猪圆环病毒Cap蛋白的分泌表达及其免疫原性研究[J]. 王霞,陈孝明,范红结,王贵平,李中圣. 畜牧与兽医. 2012(11)
[4]猪圆环病毒2型Cap蛋白在杆状病毒系统表达及鉴定[J]. 宋月,姜艳萍,崔文,李一经. 东北农业大学学报. 2012(03)
[5]表达猪圆环病毒2型SH1分离株Cap蛋白的重组杆状病毒的构建与鉴定[J]. 李文良,王先炜,马涛,李玉峰,姜平. 中国兽医科学. 2010(11)
[6]猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达[J]. 敬晓棋,吴发兴,丛丽媛,张佩君,陈德坤. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2010(05)
[7]猪圆环病毒2型Cap蛋白核定位信号区抗原表位的鉴定[J]. 郭龙军,陆月华,黄立平,危艳武,刘长明. 中国农业科学. 2010(07)
[8]猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达[J]. 郭春艳,葛俊伟,李一经. 东北农业大学学报. 2009(06)
[9]猪圆环病毒2型核酸疫苗的构建及其免疫效果[J]. 王新,郭万柱,周婷,徐志文,王印,王小玉. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2008(08)
[10]Detection of PCV2 DNA by SYBR Green I-based quantitative PCR[J]. HABIB Mudasser. Journal of Zhejiang University（Science B:An International Biomedicine & Biotechnology Journal）. 2007(03)
博士论文
[1]PCV-2 ORF2蛋白在杆状病毒表面的展示及动物免疫试验[D]. 邢福珊.西北农林科技大学 2011
硕士论文
[1]猪圆环病毒2型单克隆抗体的研制及其PCV2抗体竞争ELISA检测方法的建立与初步应用[D]. 苏相亭.扬州大学 2013
[2]猪圆环病毒2a和2b亚型灭活疫苗及亚单位疫苗的交互免疫研究[D]. 付玉洁.中国农业科学院 2012
[3]杆状病毒表达系统介导的猪圆环病毒2型基因工程疫苗的研究[D]. 宋丽.华中农业大学 2011
[4]PRRSV、CSFV和PCV-2多重PCR诊断方法及基因芯片诊断方法的建立[D]. 叶芬.西南大学 2011
本文编号：3591684
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
主要符号列表
文献综述
引言
1 材料与方法
1.1 实验菌株、质粒和血清
1.2 酶类与主要试剂(盒)
1.3 主要培养基与溶液的配置
1.4 实验动物及细胞株
1.5 主要仪器
1.6 PCV2 WH株去信号肽ORF2基因的原核表达及其抗体的制备
1.6.1 引物的设计与合成
1.6.2 病毒DNA的提取及目的基因的获得
1.6.3 目的基因与表达载体的连接
1.6.4 重组Cap蛋白的诱导表达及分析
1.6.5 重组Cap蛋白的纯化
1.6.6 重组Cap蛋白的Western blotting鉴定
1.6.7 重组Cap蛋白的浓度测定
1.6.8 抗重组Cap蛋白血清的制备
1.6.9 PCV2 WH株感染PK-15细胞的检测
1.7 PCV2 ORF2基因在昆虫细胞中的表达
1.7.1 杆状病毒转移载体的构建
1.7.2 重组穿梭载体rBacmid-Cap2的构建
1.7.3 重组杆状病毒的获得与病毒扩增
1.7.4 重组Cap蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达及鉴定
1.7.5 病毒的滴度测定
1.7.6 重组Cap蛋白表达条件的优化
1.8 重组Cap蛋白免疫小鼠实验
1.8.1 样品的处理及实验动物分组
1.8.2 对免疫小鼠血清抗体动态监测
1.8.3 免疫小鼠血清抗体中和活性的分析
2 结果与分析
2.1 PCV2 WH株去信号肽ORF2基因的原核表达及其抗体的制备
2.1.1 目的基因的扩增
2.1.2 表达重组质粒pET-32a-cap2的鉴定
2.1.3 重组Cap蛋白的诱导表达、可溶性分析及纯化
2.1.4 重组Cap蛋白的浓度测定
2.1.5 PCV2 WH株感染PK-15细胞的检测
2.2 PCV2 ORF2优化基因在昆虫细胞中的表达
2.2.1 重组转移载体pFastBac~(TM)HTA-cap2的鉴定
2.2.2 重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-cap2的鉴定
2.2.3 重组杆状病毒的获得及鉴定
2.2.4 Western blotting分析重组Cap蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达
2.2.5 间接免疫荧光(IFA)检测目的蛋白的表达
2.2.6 病毒滴度的测定
2.2.7 重组Cap蛋白表达条件的优化
2.3 重组Cap蛋白免疫小鼠实验
2.3.1 免疫小鼠血清抗体动态监测分析
2.3.2 免疫小鼠血清中和效价的测定
3 讨论
3.1 PCV2 WH株ORF2基因的序列分析及其原核表达
3.2 杆状病毒表达系统的选择
3.3 核衣壳蛋白Cap在Sf9昆虫表达及影响其表达的因素
3.4 重组Cap蛋白免疫小鼠试验
4 结论
参考文献
附录
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立[J]. 申世川,王一成,袁秀芳,徐丽华,李军星. 浙江农业学报. 2013(01)
[2]猪圆环病毒2型Rep和Rep’蛋白免疫原性及其抗体中和活性的测定[J]. 刘丹,王一平,危艳武,唐青海,吴洪丽,刘建波,李胜斌,魏萍,刘长明. 中国兽医科学. 2012(12)
[3]猪圆环病毒Cap蛋白的分泌表达及其免疫原性研究[J]. 王霞,陈孝明,范红结,王贵平,李中圣. 畜牧与兽医. 2012(11)
[4]猪圆环病毒2型Cap蛋白在杆状病毒系统表达及鉴定[J]. 宋月,姜艳萍,崔文,李一经. 东北农业大学学报. 2012(03)
[5]表达猪圆环病毒2型SH1分离株Cap蛋白的重组杆状病毒的构建与鉴定[J]. 李文良,王先炜,马涛,李玉峰,姜平. 中国兽医科学. 2010(11)
[6]猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达[J]. 敬晓棋,吴发兴,丛丽媛,张佩君,陈德坤. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2010(05)
[7]猪圆环病毒2型Cap蛋白核定位信号区抗原表位的鉴定[J]. 郭龙军,陆月华,黄立平,危艳武,刘长明. 中国农业科学. 2010(07)
[8]猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达[J]. 郭春艳,葛俊伟,李一经. 东北农业大学学报. 2009(06)
[9]猪圆环病毒2型核酸疫苗的构建及其免疫效果[J]. 王新,郭万柱,周婷,徐志文,王印,王小玉. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2008(08)
[10]Detection of PCV2 DNA by SYBR Green I-based quantitative PCR[J]. HABIB Mudasser. Journal of Zhejiang University（Science B:An International Biomedicine & Biotechnology Journal）. 2007(03)
博士论文
[1]PCV-2 ORF2蛋白在杆状病毒表面的展示及动物免疫试验[D]. 邢福珊.西北农林科技大学 2011
硕士论文
[1]猪圆环病毒2型单克隆抗体的研制及其PCV2抗体竞争ELISA检测方法的建立与初步应用[D]. 苏相亭.扬州大学 2013
[2]猪圆环病毒2a和2b亚型灭活疫苗及亚单位疫苗的交互免疫研究[D]. 付玉洁.中国农业科学院 2012
[3]杆状病毒表达系统介导的猪圆环病毒2型基因工程疫苗的研究[D]. 宋丽.华中农业大学 2011
[4]PRRSV、CSFV和PCV-2多重PCR诊断方法及基因芯片诊断方法的建立[D]. 叶芬.西南大学 2011
本文编号：3591684
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