PRRSV感染骨髓组织实时定量PCR内参基因的选择及ASAH1基因表达影响研究
发布时间：2022-01-19 10:27
目的：内参基因作为RT-PCR反应体系中的内源性参照,起到标准化对定量数据的重要作用。但是在PRRSV感染条件下的骨髓中,常见内参基因表达有可能发生改变,因此需要筛选稳定表达的基因作为内参。本实验室建立了PRRSV感染骨髓组织的数字化基因表达谱,通过生物信息学分析筛选得到差异表达的基因酸性神经酰胺酶ASAH1,并初步探索PRRSV感染过程中ASAH1与病毒和宿主的相互作用,为更好地理解PRRSV感染的分子机理提供参考。方法：采用荧光定量技术检测9个常用内参基因在PRRSV感染骨髓中的表达差异,并应用geNorm软件评估基因的表达稳定性；采用荧光定量PCR和免疫印迹技术检测ASAH1基因在PRRSV感染条件下表达水平的影响。结果：在PRRSV感染的骨髓组织中,β-actin是表达最稳定的基因,而Bm2是表达最不稳定的基因,稳定性由高到低依次为β-actin>GAPDH>SDHA>5S>18S>TOP2B> HPRT>PKGl>Bm2;差异表达的基因ASAH1,在数字化基因表达谱中显著上调：荧光定量PCR结果显示ASAH1基因转录水平显著上调...
【文章来源】：山西农业大学山西省
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
总RNA提取电泳图
图1总RNA提取电泳图Fig. 1 Total RNA extracted1.1.2 内参基因实时焚光定量结果2_aact法应用的前提是目的基因与内参基因扩增效率一致，理论上PCR扩增是递增的，以2的倍数向上递增，这时的扩增率是100%，但是实际上的实验不能保证扩增效率是100%，有时因为实验条件、试剂等原因扩增效率还有可能大于100%。通过标准曲线來计算扩增效率。PCR扩增效率是10倍的(-1/slope)减1。*1' ‘ ‘ f f 丨 I ■(」]I 」’，‘'I ‘ f 厂 1" ‘ I j' ‘ I “‘ ■ J
2总RNA提取电泳图（1-3:空白对照组；4-6:病毒感染组）. 12 Total RNA extracted from marrow (1-3: control; 4-6: PRRSV)检测及测序cDNA为模板，分别扩增ASAH1基因和p-actin基因，扩，检测结果如下图。由图可知，ASAH1基因扩增特异性量Marker比较可知扩增片段大小为140bp左右，与引物，扩增特异性较好，无非特异扩增，与分子量Marker比，与引物扩增片段114bp吻合。图13PCR产物电泳结果
【参考文献】：
期刊论文
[1]高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析[J]. 童光志,周艳君,郝晓芳,田志军,仇华吉,彭金美,安同庆. 中国预防兽医学报. 2007(05)
[2]PCR定量方法概述[J]. 宋敏,胡建民,何孔旺. 上海畜牧兽医通讯. 2005(02)
[3]猪繁殖与呼吸综合征的血清学调查[J]. 杨小燕,李晓华,沈绍新,戴爱玲. 中国兽医杂志. 2001(04)
[4]猪生殖-呼吸综合征病毒蛋白的结构与功能[J]. 仇华吉,周彦君,童光志. 动物医学进展. 2000(02)
[5]猪繁殖 - 呼吸道综合征病毒（PRRSV）CH-1a株基因型鉴定[J]. 仇华吉,郭宝清,童光志,刘文兴,于力. 中国兽医学报. 1998(02)
[6]应用间接免疫荧光法从国内生殖障碍综合征猪群中检测生殖和呼吸综合征阳性抗体的研究[J]. 郭宝清,陈章水,刘文兴,崔益洙. 中国兽医科技. 1996(03)
[7]从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J]. 郭宝清,陈章水,刘文兴,崔益洙. 中国畜禽传染病. 1996(02)
本文编号：3596690
【文章来源】：山西农业大学山西省
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
总RNA提取电泳图
图1总RNA提取电泳图Fig. 1 Total RNA extracted1.1.2 内参基因实时焚光定量结果2_aact法应用的前提是目的基因与内参基因扩增效率一致，理论上PCR扩增是递增的，以2的倍数向上递增，这时的扩增率是100%，但是实际上的实验不能保证扩增效率是100%，有时因为实验条件、试剂等原因扩增效率还有可能大于100%。通过标准曲线來计算扩增效率。PCR扩增效率是10倍的(-1/slope)减1。*1' ‘ ‘ f f 丨 I ■(」]I 」’，‘'I ‘ f 厂 1" ‘ I j' ‘ I “‘ ■ J
2总RNA提取电泳图（1-3:空白对照组；4-6:病毒感染组）. 12 Total RNA extracted from marrow (1-3: control; 4-6: PRRSV)检测及测序cDNA为模板，分别扩增ASAH1基因和p-actin基因，扩，检测结果如下图。由图可知，ASAH1基因扩增特异性量Marker比较可知扩增片段大小为140bp左右，与引物，扩增特异性较好，无非特异扩增，与分子量Marker比，与引物扩增片段114bp吻合。图13PCR产物电泳结果
【参考文献】：
期刊论文
[1]高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析[J]. 童光志,周艳君,郝晓芳,田志军,仇华吉,彭金美,安同庆. 中国预防兽医学报. 2007(05)
[2]PCR定量方法概述[J]. 宋敏,胡建民,何孔旺. 上海畜牧兽医通讯. 2005(02)
[3]猪繁殖与呼吸综合征的血清学调查[J]. 杨小燕,李晓华,沈绍新,戴爱玲. 中国兽医杂志. 2001(04)
[4]猪生殖-呼吸综合征病毒蛋白的结构与功能[J]. 仇华吉,周彦君,童光志. 动物医学进展. 2000(02)
[5]猪繁殖 - 呼吸道综合征病毒（PRRSV）CH-1a株基因型鉴定[J]. 仇华吉,郭宝清,童光志,刘文兴,于力. 中国兽医学报. 1998(02)
[6]应用间接免疫荧光法从国内生殖障碍综合征猪群中检测生殖和呼吸综合征阳性抗体的研究[J]. 郭宝清,陈章水,刘文兴,崔益洙. 中国兽医科技. 1996(03)
[7]从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J]. 郭宝清,陈章水,刘文兴,崔益洙. 中国畜禽传染病. 1996(02)
本文编号：3596690
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