艰难梭菌—GDH的原核表达、纯化与胶体金免疫层析检测方法的建立
发布时间：2022-01-19 16:12
艰难梭菌（Clostridium difficile,CD）,作为人肠道常驻菌,是引起抗生素相关性腹泻的主要病原菌,也是院内腹泻的主要致病菌。CDI诊断一般采用两步法,首先针对产毒株和非产毒株均有稳定表达的膜蛋白—谷氨酸脱氢酶（GDH）采用ELISA进行初筛,阳性病例再进行细胞毒素中和试验进行毒素检测。国内目前尚无针对CDI的系统的流行病调查报告,也没有批准的商品化检测试剂盒。本实验拟建立针对GDH的胶体金免疫层析检测方法,为CDI的临床检测、流行病调查,提供一种新的、高特异性检测方法。实验以CD630菌株的全基因组序列为模板,PCR方法克隆GDH完整序列,构建pET30a（GDH）表达质粒,转化至E coli BL21表达菌株,原核表达谷氨酸脱氢酶（GDH）,并对表达条件进行优化。成功表达后,采用Ni-NTA亲和层析法进行纯化,并以纯化后蛋白为抗原,免疫家兔制备多克隆抗体。随后,以纯化的GDH—多克隆抗体为免疫金抗体,GDH—单克隆抗体为检测线包被抗体,建立艰难梭菌—GDH胶体金免疫层析检测方法。通过原核表达系统,高效表达GDH蛋白,经过SDS-PAGE分析,表达的GDH大小约51k...
【文章来源】：黑龙江八一农垦大学黑龙江省
【文章页数】：94 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
艰难梭菌感染风险因素Fig.1-1RiskfactorsofCDI（SeekatzAM,2014）
图 1-2 艰难梭菌孢子萌发与毒素蛋白致病机制Fig.1-2 Spore germination and pathogenesis mechanism of CD（SeekatzAM, 20142 肠道微生物的破坏与 CDI 风险因素难梭菌的主要致病因素是肠道微生物菌群的破坏，健康状态下的肠道微防止病原微生物定植，称为定植抗性（colonization resistance）[54]。一定的微生物群落能够抑制病原体定植，并且相关研究已经提出了多种机菌群失调导致定制抗性的缺失，包括营养竞争（competition for nutrients竞争（ecological competition），群落排斥（niche exclusion）[55]。虽然关的许多因素都可能导致微生物群落的破坏，但最常见的相关因素是抗用。Dethlefsen 等人发现，患者在口服环丙沙星并停药之后，虽然肠道进行重建，但是其组分和服药之前并不相同[56]。而与 CDI 感染风险的
cdt E、cdt D 对毒素 A 和毒素 B 起到正向调节作用（图1-3）。在早期的相关研究中，以 TcdA 为针对对象较多（2003 以前），前文提到毒素 A 是一种肠毒素，其毒素作用主要针对肠道上皮组织。毒素 A 对白细胞有明显的趋化作用，其受体主要分布于肠粘膜刷状缘细胞上（Fig.1-2），与受体结合后改变肌动蛋白细胞骨架，从而进一步引发组织炎性反应，动物病理模型以肠粘膜上皮水肿、渗出为主[73.74]：Tcd B 以细胞毒性为主，目前研究者们认为毒素 B的致病机制为诱导细胞凋亡，毒素 B 首先与细胞表面受体结合
【参考文献】：
期刊论文
[1]三种不同方法检测乙型肝炎表面抗原的结果比较[J]. 赵凤华,赵子瑜,李燕妮. 右江民族医学院学报. 2017(02)
[2]免疫层析技术在食品违禁成分检测中的应用[J]. 杨惠程. 食品安全导刊. 2017(09)
[3]水产品中氯霉素残留胶体金免疫层析法快速检测技术[J]. 赵芸,邹礼根,柳爱春. 杭州农业与科技. 2016 (06)
[4]艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的表达及抗原性分析[J]. 王建霞,杨锡琴,金大智,黄忱,罗芸,宋晓国,王宏伟,冯晓燕,张贺秋. 军事医学. 2016(09)
[5]胶体金免疫层析试纸条在禽病检测方面的应用与展望[J]. 秦立得,南文龙,陈义平. 中国动物检疫. 2016(08)
[6]胶体金免疫层析技术在食品检测中的运用[J]. 周欣睿. 食品安全导刊. 2016(12)
[7]饲料中黄曲霉毒素检测方法研究进展[J]. 刘利晓,张亮,向艳娥,黄志伟,李洪波,崔佳. 畜牧与饲料科学. 2016(03)
[8]美国艰难梭菌感染临床诊治相关指南摘要[J]. 贾天野,汤一苇,曲芬. 传染病信息. 2015(04)
[9]2种不同检测模式下的林可霉素胶体金试纸条的比较研究[J]. 周洁,徐飞,吴超,刘文丽,丁双阳. 中国畜牧兽医. 2014(07)
[10]艰难梭状芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶的原核表达、纯化及其酶活性[J]. 杜茜,吴志鹃,蔡雪飞,袁作为,张君,郑建. 中国生物制品学杂志. 2013(07)
博士论文
[1]狂犬病毒G，N基因的表达、单克隆抗体制备与胶体金免疫层析检测试纸的研制[D]. 高明华.吉林大学 2007
硕士论文
[1]基于密码子优化的VP1基因表达蛋白检测1型和3型鸭甲肝病毒抗体的胶体金试纸条[D]. 卿莉.四川农业大学 2016
本文编号：3597167
【文章来源】：黑龙江八一农垦大学黑龙江省
【文章页数】：94 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
艰难梭菌感染风险因素Fig.1-1RiskfactorsofCDI（SeekatzAM,2014）
图 1-2 艰难梭菌孢子萌发与毒素蛋白致病机制Fig.1-2 Spore germination and pathogenesis mechanism of CD（SeekatzAM, 20142 肠道微生物的破坏与 CDI 风险因素难梭菌的主要致病因素是肠道微生物菌群的破坏，健康状态下的肠道微防止病原微生物定植，称为定植抗性（colonization resistance）[54]。一定的微生物群落能够抑制病原体定植，并且相关研究已经提出了多种机菌群失调导致定制抗性的缺失，包括营养竞争（competition for nutrients竞争（ecological competition），群落排斥（niche exclusion）[55]。虽然关的许多因素都可能导致微生物群落的破坏，但最常见的相关因素是抗用。Dethlefsen 等人发现，患者在口服环丙沙星并停药之后，虽然肠道进行重建，但是其组分和服药之前并不相同[56]。而与 CDI 感染风险的
cdt E、cdt D 对毒素 A 和毒素 B 起到正向调节作用（图1-3）。在早期的相关研究中，以 TcdA 为针对对象较多（2003 以前），前文提到毒素 A 是一种肠毒素，其毒素作用主要针对肠道上皮组织。毒素 A 对白细胞有明显的趋化作用，其受体主要分布于肠粘膜刷状缘细胞上（Fig.1-2），与受体结合后改变肌动蛋白细胞骨架，从而进一步引发组织炎性反应，动物病理模型以肠粘膜上皮水肿、渗出为主[73.74]：Tcd B 以细胞毒性为主，目前研究者们认为毒素 B的致病机制为诱导细胞凋亡，毒素 B 首先与细胞表面受体结合
【参考文献】：
期刊论文
[1]三种不同方法检测乙型肝炎表面抗原的结果比较[J]. 赵凤华,赵子瑜,李燕妮. 右江民族医学院学报. 2017(02)
[2]免疫层析技术在食品违禁成分检测中的应用[J]. 杨惠程. 食品安全导刊. 2017(09)
[3]水产品中氯霉素残留胶体金免疫层析法快速检测技术[J]. 赵芸,邹礼根,柳爱春. 杭州农业与科技. 2016 (06)
[4]艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的表达及抗原性分析[J]. 王建霞,杨锡琴,金大智,黄忱,罗芸,宋晓国,王宏伟,冯晓燕,张贺秋. 军事医学. 2016(09)
[5]胶体金免疫层析试纸条在禽病检测方面的应用与展望[J]. 秦立得,南文龙,陈义平. 中国动物检疫. 2016(08)
[6]胶体金免疫层析技术在食品检测中的运用[J]. 周欣睿. 食品安全导刊. 2016(12)
[7]饲料中黄曲霉毒素检测方法研究进展[J]. 刘利晓,张亮,向艳娥,黄志伟,李洪波,崔佳. 畜牧与饲料科学. 2016(03)
[8]美国艰难梭菌感染临床诊治相关指南摘要[J]. 贾天野,汤一苇,曲芬. 传染病信息. 2015(04)
[9]2种不同检测模式下的林可霉素胶体金试纸条的比较研究[J]. 周洁,徐飞,吴超,刘文丽,丁双阳. 中国畜牧兽医. 2014(07)
[10]艰难梭状芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶的原核表达、纯化及其酶活性[J]. 杜茜,吴志鹃,蔡雪飞,袁作为,张君,郑建. 中国生物制品学杂志. 2013(07)
博士论文
[1]狂犬病毒G，N基因的表达、单克隆抗体制备与胶体金免疫层析检测试纸的研制[D]. 高明华.吉林大学 2007
硕士论文
[1]基于密码子优化的VP1基因表达蛋白检测1型和3型鸭甲肝病毒抗体的胶体金试纸条[D]. 卿莉.四川农业大学 2016
本文编号：3597167
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