猪BMP-3b基因克隆及转录调控的研究

发布时间：2022-01-20 11:31

　　肌肉和脂肪是影响猪肌肉品质重要因素,提高肌肉品质是育种工作者的重要目标之一,随着分子生物学的发展,猪的育种技术已从常规育种逐渐向分子育种的方向过渡。因此,了解影响猪肌肉和脂肪组织的相关基因的转录调控机理,有助于为分子育种打下良好的基础。为此,我们做了如下研究：（1）通过5’RACE鉴定了猪BMP-3b基因的转录起始位点,发现该基因的转录起始位点翻译起始位点上游278bp处的鸟嘌呤,并将其定为+1。（2）通过NCBI和EBI获得了猪BMP-3b基因5’端上游调控序列,我们克隆了该基因5’端上游调控序列1458bp。利用生物信息学的方法预测了猪BMP-3b基因5’端上游调控区域,发现了TATA-box和GC-box,预测到了多个与脂肪相关的C/EBP转录因子结合位点。并比较不同物种的近端启动区,发现在-51--36bp处高度保守,该区域位于两个GC-box中。（3）构建了8段5’端系列缺失片段的双荧光素酶报告基因载体,并在3种真核细胞系中检测了它们的荧光活性,并对活性较高的PF2段缺失又进行了5段缺失,同样检测它们的荧光活性,发现在-46--39可能是该基因的核心区域。（4）通过点突变的方... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1 前言
    2 猪脂肪相关基因的研究进展
        2.1 二酰基甘油酰基转移酶1
        2.2 激素敏感性脂肪酶
        2.3 脂蛋白酯酶基因
        2.4 过氧化物酶体增殖物激活受体γ
    3 启动子的结构功能研究
        3.1 启动子基本结构
        3.2 真核生物启动子预测相关数据库
        3.3 真核生物启动子功能研究
    4 DNA甲基化
        4.1 表观遗传学的相关研究
        4.2 DNA甲基化的修饰模式
        4.3 DNA甲基化的检测方法
    5 BMP-3b基因研究进展
    6 研究的目的和意义
第二章 实验材料和方法
    1 试验材料
        1.1 主要的生化试剂和药品
        1.2 细胞、菌株和载体及猪基因组DNA
        1.3 试剂盒
        1.4 组织表达谱分析的样品
        1.5 DNA甲基化分析的样品
        1.6 主要的仪器、设备及耗材
        1.7 缓冲液和常用试剂的配制
        1.8 主要的生物学软件和网站
    2 试验方法
        2.1 猪BMP-3b基因5’端上游调控区域的克隆和分析
        2.2 猪BMP-3b基因转录起始位点的鉴定
        2.3 猪BMP-3b基因近端启动子缺失分析
        2.4 核心启动区的进一步寻找和验证
        2.5 定点突变的验证试验
        2.6 猪BMP-3b基因组织表达谱分析
        2.7 核心启动区甲基化研究
        2.8 BMP-3b超表达实验
第三章 实验结果与分析
    1 猪BMP-3b基因启动子核心位点的寻找
        1.1 猪BMP-3b基因5’端上游调控区域克隆和分析
        1.2 猪BMP-3b基因转录起始位点的鉴定
        1.3 猪BMP-3b基因5’端上游调控区域的生物信息学分析
        1.4 不同物种BMP-3b基因近端启动子序列比对
        1.5 猪BMP-3b基因5’端上游调控区域的缺失载体的构建
        1.6 启动子在三种不同真核细胞中活性分析结果
        1.7 细致缺失载体的构建
        1.8 细致缺失片段在PK细胞中的活性分析
        1.9 点突变分析的验证
    2 猪BMP-3b基因组织表达谱分析
        2.1 RNA的提取
        2.2 第一链cDNA检测结果
        2.3 猪BMP-3b基因在猪不同组织中的表达结果
    3 核心启动区甲基化分析
        3.1 猪BMP-3b基因启动子和外显子CpG岛预测
        3.2 核心启动区的甲基化扩增结果
        3.3 甲基化测序结果与分析
        3.4 猪BMP-3b基因核心启动区不同时期的甲基化情况
        3.5 猪BMP-3b基因组织表达与甲基化相关性分析
    4 猪BMP-3b的超表达实验
        4.1 不同物种BMP-3b基因氨基酸序列比对
        4.2 猪BMP-3b基因CDS全长的克隆及双酶切鉴定
        4.3 PCDNA3.1-CDS在PK细胞中的转染
        4.4 荧光定量PCR检测结果
第四章 讨论
    1 关于猪BMP-3b基因生物信息学与转录调控分析
        1.1 猪BMP-3b基因序列分析
        1.2 猪BMP-3b基因启动子的转录调控分析
    2 猪BMP-3b基因启动子甲基化与组织表达谱分析
    3 猪BMP-3b基因的超表达实验分析
第五章 小结
    1 本实验得到的结论
    2 下一步工作设想
参考文献
附录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]真核生物启动子的鉴定方法[J]. 石慧,李建远.  中外医学研究. 2012(08)
[2]真核生物启动子的研究及应用[J]. 黄玉,杨波,迟小华,刘丽宏,李薇,卢学春.  生物技术通讯. 2010(02)
[3]启动子序列克隆和功能分析方法的研究进展[J]. 杨晓娜,赵昶灵,李云,李会容,苏丽,周燕琼.  云南农业大学学报(自然科学版). 2010(02)
[4]猪脂肪性状相关基因的研究进展[J]. 李培培,戈新,王建华,张宝珣,江科,曲明祥.  中国畜牧兽医. 2010(01)
[5]表观遗传学的分子机制及其研究进展[J]. 孙永健,陈小强,孙宁,张磊.  安徽农业科学. 2008(33)
[6]饲粮营养水平对猪血液生化指标、背最长肌IMF含量及LPLmRNA表达量的影响[J]. 廉红霞,卢德勋,高民.  中国饲料. 2008(05)
[7]猪激素敏感脂肪酶基因外显子1的遗传多态性分析[J]. 薛慧良,徐来祥.  细胞生物学杂志. 2007(05)
[8]DNA甲基化——肿瘤产生的一种表观遗传学机制[J]. 张丽丽,吴建新.  遗传. 2006(07)
[9]启动子克隆概述[J]. 孙晓红,陈明杰,潘迎捷.  食用菌学报. 2002(03)

博士论文
[1]猪PPARΓ2基因肌肉超表达真核表达载体构建以及在转基因小鼠中的功能验证[D]. 黄锦亮.华中农业大学 2012
[2]猪肌肉发育相关基因Six1与Pitx2c的分离克隆、表达模式及功能研究[D]. 吴望军.华中农业大学 2011
[3]大白×梅山猪杂交组合亲子代间脂肪组织差异表达基因的分离和功能初步研究[D]. 任竹青.华中农业大学 2007



本文编号：3598744