副猪嗜血杆菌血清4型菌株的蛋白质组学研究
发布时间：2022-01-20 13:08
近几年来,临床上表现为多发性纤维素性浆膜炎、关节炎的病猪屡见不鲜,从患病猪的病理脏器中分离出副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis,HPS）的比例越来越高,但对其致病机理尚不清楚。本研究选取2株副猪嗜血杆菌血清4型菌株进行比较蛋白质组学和免疫蛋白质组学研究,以揭示其致病机制。1副猪嗜血杆菌二维双向凝胶电泳条件的建立和优化本研究主要对裂解液配方、上样量以及聚焦时间进行优化,建立了适宜的副猪嗜血杆菌二维双向电泳凝胶技术。通过超声-裂解液-离心法提取全蛋白,裂解液配方为7M尿素,2M硫脲,4%CHAPS,40mMDTT,2%IPGbuffer。上样时使用2D clean-up kit以及加入去拖尾DeStreak试剂。采用银染方法确定了 24cm胶条上样量为5000μg。一向等电聚焦程序为:30V12h、100V2h、200Vlh、500V lh、1000V3h、2000V 2h、8000V3h、60000 Vh、500V10h。2副猪嗜血杆菌血清4型菌株的差异蛋白质组学研究先通过二维双向凝胶电泳技术和PDQest8.0软件分析获取23个差异表达蛋白,再运用MALDI-TOF-...
【文章来源】：福建农林大学福建省
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－２副猪嗜血杆菌的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱??
?ｐＨ４?—７??Ｋ?剩??８Ｍ尿素裂解液制备样品的２－Ｄ图谙?７Ｍ尿素裂解液制备样品的２－Ｄ图谐??图２－３不同蛋白裂解液提取样品的双向电泳图谱??Ｆｉｇ．?２－３?２－Ｄ?ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｐａｇｅｓ?ｏｆ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｌｙｓｉｓ?ｂｕｆｆｅｒ??蛋白样品的有效溶解是双向电泳成功分离蛋白质的关键因素之一，裂解液中??尿素作为常用的变性剂，其常用浓度为８Ｍ，过低则不能达到完全溶解蛋白的目??的。硫脲的添加则可以帮助许多难溶蛋白进行溶解，特别是膜蛋白，二者共同作??用能够破坏蛋白分子间的氢键，从而防止由氢键引起蛋白质聚集以及蛋白迁移中??二级结构的形成。由于硫脲在水中的溶解度低，高浓度尿素可增强其溶解度，因??此通常选用７Ｍ尿素和２Ｍ硫脲的混合溶液。??如上图，相同的上样量和聚焦程序，使用８Ｍ尿素裂解液不能彻底溶解样品??中的蛋白，在酸性端出现大量水平拖尾现象，蛋白点不能很好分开；使用７Ｍ尿??素裂解液
未用试剂盒处理的样品?用试剂盒处理的样品??图２－４用２－Ｄ?ｃｌｅａｎ?ｕｐ试剂盒对样品处理前后的双向电泳图谱??Ｆｉｇ．?２－４?Ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ?ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｐａｇｅｓ?ｏｆ?ｂｅｆｏｒｅ?ａｎｄ?ａｆｔｅｒ?ｕｓｉｎｇ?２－Ｄ??ｃｌｅａｎ?ｕｐ?ｋｉｔ??双向电泳对蛋白样品的要求非常严格，样品中任何杂质都会对后续的等点聚??焦过程产生影响。用２－Ｄ?ｄｅａｎ?ｕｐ试剂盒对样品处理前后的双向电泳结果比较发??现，未用试剂盒处理的样品中含有少量杂质，出现水平条纹，部分蛋白溶解度差??影响了电泳的分辨率；用试剂盒处理的样品，因去除了样品中各种去污剂、盐份、??多肽、核酸、脂类、酚类和其他一些离子，保持了样品的溶解性，减少了水平条??纹的发生，提高了电泳的分辨率，图谱中蛋白点清晰、聚焦效果很好，而且使用??试剂盒没有造成斑点的增加或减少，或斑点位置变化，明显使用２－Ｄ?ｃｌｅａｎ?ｕｐ试??剂盒处理样品的图谱要好于没有用试剂盒处理的图谱。因此，在开始双向电泳前??需先用２－Ｄ?ｃｌｅａｎ?ｕｐ试剂盒来处理样品。??３．５样品上样量的确定（２４ｃｍ）??采用２根２４ｃｍ胶条
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪链球菌二氢硫辛酰胺脱氢酶的原核表达及其粘附相关功能初探[J]. 张静,孙建和. 上海交通大学学报(农业科学版). 2012(02)
[2]副猪嗜血杆菌血清5型TbpA蛋白的表达及其免疫原性分析[J]. 李建军,胡明明,朱晓凯,李艳玲,张艳禾,谢芳,王春来. 中国预防兽医学报. 2012(03)
[3]猪胸膜肺炎放线杆菌转铁结合蛋白基因（TbpB）分析及建模[J]. 李任峰,田香勤,何启盖,胡建和,赵朴,李学斌,王三虎. 生物信息学. 2010(01)
[4]丝氨酸蛋白酶研究进展[J]. 汪世华,王文勇,黄益洲,林琳,沙莉. 福建农业学报. 2007(04)
[5]副猪嗜血杆菌病研究进展[J]. 华升,梅书棋,曾德芳,徐涤平,李勇. 动物医学进展. 2006(11)
[6]蛋白质组学分析多重耐药的铜绿假单胞菌[J]. 乐军,蒋晓飞,梁莉,吕元. 中国抗生素杂志. 2006(08)
[7]异烟肼耐药和敏感结核分枝杆菌的比较蛋白质组学研究[J]. 乐军,刘丽蓉,谢建平,刘蓓,梁莉,王洪海. 中华微生物学和免疫学杂志. 2004(04)
[8]大肠杆菌周质和外膜蛋白的定位[J]. 葛高翔,林其谁. 生物化学与生物物理进展. 2000(06)
[9]功能蛋白质组学[J]. 生命的化学. 1998(06)
[10]细菌蛋白酶的致病作用[J]. 李瑞武. 国外医学(微生物学分册). 1998(03)
博士论文
[1]副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究[D]. 蔡旭旺.华中农业大学 2006
本文编号：3598882
【文章来源】：福建农林大学福建省
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－２副猪嗜血杆菌的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱??
?ｐＨ４?—７??Ｋ?剩??８Ｍ尿素裂解液制备样品的２－Ｄ图谙?７Ｍ尿素裂解液制备样品的２－Ｄ图谐??图２－３不同蛋白裂解液提取样品的双向电泳图谱??Ｆｉｇ．?２－３?２－Ｄ?ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｐａｇｅｓ?ｏｆ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｌｙｓｉｓ?ｂｕｆｆｅｒ??蛋白样品的有效溶解是双向电泳成功分离蛋白质的关键因素之一，裂解液中??尿素作为常用的变性剂，其常用浓度为８Ｍ，过低则不能达到完全溶解蛋白的目??的。硫脲的添加则可以帮助许多难溶蛋白进行溶解，特别是膜蛋白，二者共同作??用能够破坏蛋白分子间的氢键，从而防止由氢键引起蛋白质聚集以及蛋白迁移中??二级结构的形成。由于硫脲在水中的溶解度低，高浓度尿素可增强其溶解度，因??此通常选用７Ｍ尿素和２Ｍ硫脲的混合溶液。??如上图，相同的上样量和聚焦程序，使用８Ｍ尿素裂解液不能彻底溶解样品??中的蛋白，在酸性端出现大量水平拖尾现象，蛋白点不能很好分开；使用７Ｍ尿??素裂解液
未用试剂盒处理的样品?用试剂盒处理的样品??图２－４用２－Ｄ?ｃｌｅａｎ?ｕｐ试剂盒对样品处理前后的双向电泳图谱??Ｆｉｇ．?２－４?Ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ?ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｐａｇｅｓ?ｏｆ?ｂｅｆｏｒｅ?ａｎｄ?ａｆｔｅｒ?ｕｓｉｎｇ?２－Ｄ??ｃｌｅａｎ?ｕｐ?ｋｉｔ??双向电泳对蛋白样品的要求非常严格，样品中任何杂质都会对后续的等点聚??焦过程产生影响。用２－Ｄ?ｄｅａｎ?ｕｐ试剂盒对样品处理前后的双向电泳结果比较发??现，未用试剂盒处理的样品中含有少量杂质，出现水平条纹，部分蛋白溶解度差??影响了电泳的分辨率；用试剂盒处理的样品，因去除了样品中各种去污剂、盐份、??多肽、核酸、脂类、酚类和其他一些离子，保持了样品的溶解性，减少了水平条??纹的发生，提高了电泳的分辨率，图谱中蛋白点清晰、聚焦效果很好，而且使用??试剂盒没有造成斑点的增加或减少，或斑点位置变化，明显使用２－Ｄ?ｃｌｅａｎ?ｕｐ试??剂盒处理样品的图谱要好于没有用试剂盒处理的图谱。因此，在开始双向电泳前??需先用２－Ｄ?ｃｌｅａｎ?ｕｐ试剂盒来处理样品。??３．５样品上样量的确定（２４ｃｍ）??采用２根２４ｃｍ胶条
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪链球菌二氢硫辛酰胺脱氢酶的原核表达及其粘附相关功能初探[J]. 张静,孙建和. 上海交通大学学报(农业科学版). 2012(02)
[2]副猪嗜血杆菌血清5型TbpA蛋白的表达及其免疫原性分析[J]. 李建军,胡明明,朱晓凯,李艳玲,张艳禾,谢芳,王春来. 中国预防兽医学报. 2012(03)
[3]猪胸膜肺炎放线杆菌转铁结合蛋白基因（TbpB）分析及建模[J]. 李任峰,田香勤,何启盖,胡建和,赵朴,李学斌,王三虎. 生物信息学. 2010(01)
[4]丝氨酸蛋白酶研究进展[J]. 汪世华,王文勇,黄益洲,林琳,沙莉. 福建农业学报. 2007(04)
[5]副猪嗜血杆菌病研究进展[J]. 华升,梅书棋,曾德芳,徐涤平,李勇. 动物医学进展. 2006(11)
[6]蛋白质组学分析多重耐药的铜绿假单胞菌[J]. 乐军,蒋晓飞,梁莉,吕元. 中国抗生素杂志. 2006(08)
[7]异烟肼耐药和敏感结核分枝杆菌的比较蛋白质组学研究[J]. 乐军,刘丽蓉,谢建平,刘蓓,梁莉,王洪海. 中华微生物学和免疫学杂志. 2004(04)
[8]大肠杆菌周质和外膜蛋白的定位[J]. 葛高翔,林其谁. 生物化学与生物物理进展. 2000(06)
[9]功能蛋白质组学[J]. 生命的化学. 1998(06)
[10]细菌蛋白酶的致病作用[J]. 李瑞武. 国外医学(微生物学分册). 1998(03)
博士论文
[1]副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究[D]. 蔡旭旺.华中农业大学 2006
本文编号：3598882
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