CRISPR/CAS9与TALENs介导奶山羊β-酪蛋白位点基因打靶效率的比较研究
发布时间：2022-01-21 07:28
由sgRNA指导Cas9内切酶从而特异性的识别基因位点并进行编辑的CRISPR/Cas9是近年兴起的一项新技术,相较于之前的锌指核酸酶技术（Zinc finger nuclease, ZFNs）和转录激活子因子效应物核酸酶技术（Transcription activator-like effector nucleases, TALENs）, CRISPR/Cas9在设计、使用方面更加简便快捷,并且不需要对序列进行特殊分析,也不需要对应地去寻找识别模块,CRISPR/Cas更易于操作,效率更高,更容易得到纯合子突变体,而且可以在不同的位点同时引入多个突变,其具有极大的应用优势。本实验是针对p一酪蛋白（β-casein, CSN2）的第二外显子的一段序列设计并构建了一组TALENs表达载体和一个CRISPR/Cas9表达载体。实验选用了具有新霉素抗性基因（Neor）表达框架的质粒为骨架,构建了两个针对TALENs. CRISPR/Cas9切割位点的同源打靶载体,分别为pFlrkt和pGlrkto其外源基因分别为人源化的Fat-1 （hFat-1）和EGFP,在CAGG启动子上游包含长102...
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一部分 实验研究
第一章 TALENs、CRISPR/Cas9以及打靶载体的构建
前言
1 试剂和设备
1.1 实验试剂和材料
1.2 仪器和设备
2 方法
2.1 TALENs载体的构建
2.2 CRISPR/Cas9载体的构建
2.3 pFlrkt打靶载体的构建
2.4 pGlrkt载体的构建
3 结果
3.1 同源臂扩增结果
3.2 载体构建结果
3.3 EGFP基因的扩增和pGlrkt载体的构建结果
4 讨论
5 小结
参考文献
第二章 CRISPR/Cas9和TALENs介导的外源基因在奶山羊β-酪蛋白基因位点的整合
前言
1 试剂和设备
1.1 实验试剂和材料
1.2 仪器设备
2 方法
2.1 打靶细胞的制备和筛选
2.2 基因组的提取
2.3 转基因细胞的鉴定
3 结果
3.1 TALENs、CRISPR/Cas9分别与Glrkt共转染后转染效率的比较
3.2 同源臂PCR鉴定结果
3.3 打靶细胞的外源基因表达检测
4 讨论
5 小结
参考文献
实验结论
第二部分 文献综述 基因组编辑技术的研究进展
前言
1 ZFNs基因编辑技术
1.1 ZFNs的结构与工作原理
1.2 ZFNs的构建
1.3 ZFNs技术的应用
1.4 ZFNs的优势和局限
2 TALENs基因编辑技术
2.1 TALENs的结构和工作原理
2.2 TALENs的构建
2.3 TALENs技术的应用
2.4 TALENs的优势和局限
3 CRISPR/Cas9基因编辑技术
3.1 CRISPR/Cas系统的结构和作用原理
3.2 CRISPRs系统的构建
3.3 CRISPR/Cas9在基因编辑中的应用
3.4 CRISPR/Cas9系统的优势和局限
4 展望
参考文献
致谢
攻读学位期间申请的专利
【参考文献】：
期刊论文
[1]Efficient and Specific Modifications of the Drosophila Genome by Means of an Easy TALEN Strategy[J]. Jiyong Liu~a,Changqing Li~a,Zhongsheng Yu~a,Peng Huang~b,Honggang Wu~a,Chuanxian Wei~a, Nannan Zhu~a,Yan Shen~b,Yixu Chen~a,Bo Zhang~b,Wu-Min Deng~(c,*),Renjie Jiao~(a,*) a State Key Laboratory of Brain and Cognitive Science,Institute of Biophysics,The Chinese Academy of Sciences,Datun Road 15,Beijing 100101,China b Key Laboratory of Cell Proliferation and Differentiation of Ministry of Education,College of Life Sciences,Peking University,Beijing 100871,China c Department of Biological Science,Florida State University,Tallahassee,Florida 32304-4295,USA. 遗传学报. 2012(05)
[2]ω-3转基因克隆绵羊诞生[J]. 段彪,程磊,苏广华,刘欣,胡晓明,刘坤,李俊龙,李光鹏. 内蒙古大学学报(自然科学版). 2011(01)
[3]秀丽隐杆线虫fat-1基因密码子优化、克隆及家兔表达载体构建[J]. 周红梅,陈哲,蔡兆伟,蒋晓玲,徐宁迎,郭晓令. 江苏农业科学. 2010(06)
[4]羊奶的优势与发展前景[J]. 徐颖,汪璇,刘小丹,魏红艳. 黑龙江畜牧兽医. 2010(14)
[5]Efficient production of omega-3 fatty acid desaturase （sFat-1）-transgenic pigs by somatic cell nuclear transfer[J]. PAN DengKe1, ZHANG Li1, ZHOU YanRong2, FENG Chong1, LONG Chuan1, LIU Xiao1, WAN Rong3, ZHANG Jian3, LIN AiXing3, DONG EnQiu4, WANG ShuChen4, XU HouGang4 & CHEN HongXing2 1 Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2 Beijing Institute of Biotechnology, Beijing 100071, China; 3 China Agricultural University, Beijing 100193, China; 4 Yutian Breeding Swine Farms, Yutian 064104, China. Science China（Life Sciences）. 2010(04)
[6]羊奶对不同人群健康的影响[J]. 焦凌梅. 中国乳业. 2008(05)
[7]C.elegans fat-1基因结构、功能及其抗肿瘤机制的研究进展[J]. 刘晓蕾,葛银林,蒋正尧. 医学分子生物学杂志. 2006(02)
[8]山羊β酪蛋白基因克隆及序列分析[J]. 王强,陈美珏,任兆瑞,黄淑帧,曾溢滔. 中国生物化学与分子生物学报. 2003(01)
[9]中国白酒的溶胶特性及其应用原理与方法[J]. 庄名扬. 酿酒. 2002(01)
博士论文
[1]ZFNs介导的牛MSTN位点的基因打靶研究[D]. 赵宇航.内蒙古大学 2014
[2]花鲈肌肉生长抑素基因（MSTN）克隆、表达及其基因打靶载体的构建[D]. 叶寒青.中国海洋大学 2006
本文编号：3599833
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一部分 实验研究
第一章 TALENs、CRISPR/Cas9以及打靶载体的构建
前言
1 试剂和设备
1.1 实验试剂和材料
1.2 仪器和设备
2 方法
2.1 TALENs载体的构建
2.2 CRISPR/Cas9载体的构建
2.3 pFlrkt打靶载体的构建
2.4 pGlrkt载体的构建
3 结果
3.1 同源臂扩增结果
3.2 载体构建结果
3.3 EGFP基因的扩增和pGlrkt载体的构建结果
4 讨论
5 小结
参考文献
第二章 CRISPR/Cas9和TALENs介导的外源基因在奶山羊β-酪蛋白基因位点的整合
前言
1 试剂和设备
1.1 实验试剂和材料
1.2 仪器设备
2 方法
2.1 打靶细胞的制备和筛选
2.2 基因组的提取
2.3 转基因细胞的鉴定
3 结果
3.1 TALENs、CRISPR/Cas9分别与Glrkt共转染后转染效率的比较
3.2 同源臂PCR鉴定结果
3.3 打靶细胞的外源基因表达检测
4 讨论
5 小结
参考文献
实验结论
第二部分 文献综述 基因组编辑技术的研究进展
前言
1 ZFNs基因编辑技术
1.1 ZFNs的结构与工作原理
1.2 ZFNs的构建
1.3 ZFNs技术的应用
1.4 ZFNs的优势和局限
2 TALENs基因编辑技术
2.1 TALENs的结构和工作原理
2.2 TALENs的构建
2.3 TALENs技术的应用
2.4 TALENs的优势和局限
3 CRISPR/Cas9基因编辑技术
3.1 CRISPR/Cas系统的结构和作用原理
3.2 CRISPRs系统的构建
3.3 CRISPR/Cas9在基因编辑中的应用
3.4 CRISPR/Cas9系统的优势和局限
4 展望
参考文献
致谢
攻读学位期间申请的专利
【参考文献】：
期刊论文
[1]Efficient and Specific Modifications of the Drosophila Genome by Means of an Easy TALEN Strategy[J]. Jiyong Liu~a,Changqing Li~a,Zhongsheng Yu~a,Peng Huang~b,Honggang Wu~a,Chuanxian Wei~a, Nannan Zhu~a,Yan Shen~b,Yixu Chen~a,Bo Zhang~b,Wu-Min Deng~(c,*),Renjie Jiao~(a,*) a State Key Laboratory of Brain and Cognitive Science,Institute of Biophysics,The Chinese Academy of Sciences,Datun Road 15,Beijing 100101,China b Key Laboratory of Cell Proliferation and Differentiation of Ministry of Education,College of Life Sciences,Peking University,Beijing 100871,China c Department of Biological Science,Florida State University,Tallahassee,Florida 32304-4295,USA. 遗传学报. 2012(05)
[2]ω-3转基因克隆绵羊诞生[J]. 段彪,程磊,苏广华,刘欣,胡晓明,刘坤,李俊龙,李光鹏. 内蒙古大学学报(自然科学版). 2011(01)
[3]秀丽隐杆线虫fat-1基因密码子优化、克隆及家兔表达载体构建[J]. 周红梅,陈哲,蔡兆伟,蒋晓玲,徐宁迎,郭晓令. 江苏农业科学. 2010(06)
[4]羊奶的优势与发展前景[J]. 徐颖,汪璇,刘小丹,魏红艳. 黑龙江畜牧兽医. 2010(14)
[5]Efficient production of omega-3 fatty acid desaturase （sFat-1）-transgenic pigs by somatic cell nuclear transfer[J]. PAN DengKe1, ZHANG Li1, ZHOU YanRong2, FENG Chong1, LONG Chuan1, LIU Xiao1, WAN Rong3, ZHANG Jian3, LIN AiXing3, DONG EnQiu4, WANG ShuChen4, XU HouGang4 & CHEN HongXing2 1 Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2 Beijing Institute of Biotechnology, Beijing 100071, China; 3 China Agricultural University, Beijing 100193, China; 4 Yutian Breeding Swine Farms, Yutian 064104, China. Science China（Life Sciences）. 2010(04)
[6]羊奶对不同人群健康的影响[J]. 焦凌梅. 中国乳业. 2008(05)
[7]C.elegans fat-1基因结构、功能及其抗肿瘤机制的研究进展[J]. 刘晓蕾,葛银林,蒋正尧. 医学分子生物学杂志. 2006(02)
[8]山羊β酪蛋白基因克隆及序列分析[J]. 王强,陈美珏,任兆瑞,黄淑帧,曾溢滔. 中国生物化学与分子生物学报. 2003(01)
[9]中国白酒的溶胶特性及其应用原理与方法[J]. 庄名扬. 酿酒. 2002(01)
博士论文
[1]ZFNs介导的牛MSTN位点的基因打靶研究[D]. 赵宇航.内蒙古大学 2014
[2]花鲈肌肉生长抑素基因（MSTN）克隆、表达及其基因打靶载体的构建[D]. 叶寒青.中国海洋大学 2006
本文编号：3599833
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