JSRV-env慢病毒过表达载体构建及其对NIH3T3细胞增殖的影响
发布时间：2022-01-21 08:23
为研究绵羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV）囊膜蛋白（Envelope,env）对NIH3T3细胞（小鼠胚胎成纤维细胞）增殖的影响,构建pCMV-dR8.91-JSRV-env慢病毒过表达载体并感染NIH3T3细胞。将JSRV-env基因连接红色荧光慢病毒报告载体pCMV-dR8.91,基因测序正确后将载体命名为pCMV-dR8.91-JSRV-env。将pCMV-dR8.91-JSRV-env重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞包装产生JSRV-env重组慢病毒。将重组慢病毒悬液利用超速离心沉淀法浓缩,real-time PCR测定病毒滴度。浓缩病毒转导NIH3T3细胞72h后,噻唑蓝（MTT）检测细胞增殖情况。结果显示:env同源重组入pCMV-dR8.91载体,测序结果与预期序列一致;pCMV-dR8.91-JSRV-env与包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞72h,real-time PCR验证JSRV-env过表达极显著（P<0.01）,JSRV-env重组慢病毒平均滴度为2.99×108...
【文章来源】：中国农业大学学报. 2020,25(07)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
pCMV-dR8.91-JSRV-env重组载体构建
将上述测序结果正确的转化子进行质粒抽提并测定浓度。5μg的pCMV-dR8.91-JSRV-env和10μg包装辅助质粒pCMV-VSV-G转染HEK293T细胞转染72h后，在荧光显微镜下可观察到在293T细胞中大量红色荧光蛋白表达，提示JSRV-env重组慢病毒包装成功（图2）。2.3 纯化的重组慢病毒滴度测定
本研究针对JSRV致癌基因env构建过表达慢病毒并进行体外NIH3T3细胞感染，为进一步了解env致瘤机制提供新的研究方法。在前人的研究中，由于JSRV-env真核质粒载体构建流程简单、试验周期短，而成为过表达JSRV-env的主要工具[5-8]。但质粒转染存在许多缺陷：首先，JSRV-env质粒在细胞内转染效率不稳定，不同细胞在不同转染方法和不用转染介质中，转染效率差别大，且大部分细胞转染效率不高；其次，JSRV-env质粒转染进入细胞核效率低，特别是阳离子脂质体对细胞损伤较大[11]。与质粒相比，病毒载体转染效率高，可实现体外细胞的高效且稳定转导[12]。目前常用的两种JSRV-env真核质粒共2种：一种为带HA标签的pcDNA3.1真核质粒[13]；另一种为带HIS标签的pcDNA4.0质粒[9]。其中，pcDNA3.1质粒需要插入SPA提高JSRV-env表达效率[13]，与JSRV-env质粒转染细胞相比，JSRV-env慢病毒载体感染细胞一方面可以过表达env；另一方面慢病毒的长末端重复序列（Long terminal repeats,LTRs）含有病毒启动子和增强子元件能够增强病毒的表达，极大地还原了病毒对细胞的作用条件，是目前JSRV-env过表达较为理想的载体[14]。图4 不同载量JSRV-env重组慢病毒感染NIH3T3细胞
【参考文献】：
期刊论文
[1]绵羊肺腺瘤病毒真核表达质粒pcDNA3.1（+）/exJSRV-env引起体内和体外细胞发生的转化[J]. 石晶,张宇飞,刘淑英. 中国兽医学报. 2017(05)
[2]绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的表达可促进NIH3T3细胞增殖[J]. 杜方原,陈大勇,张宇飞,孙晓林,郭文庆,刘淑英. 细胞与分子免疫学杂志. 2016(09)
本文编号：3599922
【文章来源】：中国农业大学学报. 2020,25(07)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
pCMV-dR8.91-JSRV-env重组载体构建
将上述测序结果正确的转化子进行质粒抽提并测定浓度。5μg的pCMV-dR8.91-JSRV-env和10μg包装辅助质粒pCMV-VSV-G转染HEK293T细胞转染72h后，在荧光显微镜下可观察到在293T细胞中大量红色荧光蛋白表达，提示JSRV-env重组慢病毒包装成功（图2）。2.3 纯化的重组慢病毒滴度测定
本研究针对JSRV致癌基因env构建过表达慢病毒并进行体外NIH3T3细胞感染，为进一步了解env致瘤机制提供新的研究方法。在前人的研究中，由于JSRV-env真核质粒载体构建流程简单、试验周期短，而成为过表达JSRV-env的主要工具[5-8]。但质粒转染存在许多缺陷：首先，JSRV-env质粒在细胞内转染效率不稳定，不同细胞在不同转染方法和不用转染介质中，转染效率差别大，且大部分细胞转染效率不高；其次，JSRV-env质粒转染进入细胞核效率低，特别是阳离子脂质体对细胞损伤较大[11]。与质粒相比，病毒载体转染效率高，可实现体外细胞的高效且稳定转导[12]。目前常用的两种JSRV-env真核质粒共2种：一种为带HA标签的pcDNA3.1真核质粒[13]；另一种为带HIS标签的pcDNA4.0质粒[9]。其中，pcDNA3.1质粒需要插入SPA提高JSRV-env表达效率[13]，与JSRV-env质粒转染细胞相比，JSRV-env慢病毒载体感染细胞一方面可以过表达env；另一方面慢病毒的长末端重复序列（Long terminal repeats,LTRs）含有病毒启动子和增强子元件能够增强病毒的表达，极大地还原了病毒对细胞的作用条件，是目前JSRV-env过表达较为理想的载体[14]。图4 不同载量JSRV-env重组慢病毒感染NIH3T3细胞
【参考文献】：
期刊论文
[1]绵羊肺腺瘤病毒真核表达质粒pcDNA3.1（+）/exJSRV-env引起体内和体外细胞发生的转化[J]. 石晶,张宇飞,刘淑英. 中国兽医学报. 2017(05)
[2]绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的表达可促进NIH3T3细胞增殖[J]. 杜方原,陈大勇,张宇飞,孙晓林,郭文庆,刘淑英. 细胞与分子免疫学杂志. 2016(09)
本文编号：3599922
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