大肠杆菌属Nissle1917胞外囊泡蛋白组分析及其对鼠巨噬细胞功能的免疫调控作用
发布时间：2022-01-22 17:11
大肠杆菌Nissle 1917（EcN）是一种革兰氏阴性益生菌,因其对肠道疾病有显著的缓解效果而被广泛用于临床治疗中。它能够通过其分泌胞外囊泡调节宿主肠上皮细胞的免疫反应。巨噬细胞是固有免疫反应中的重要免疫细胞,然而关于EcN与巨噬细胞互作报道甚少。鉴于此,本试验旨在通过分离EcN的胞外囊泡（EcNOMVs）探究其对巨噬细胞生物功能的调节作用,并利用蛋白组学技术进一步挖掘影响巨噬细胞功能的潜在免疫信号分子,为EcN在动物肠道中的免疫调节机制提供理论基础。试验包括两部分:（1）首先利用差速离心和梯度密度离心法分离和纯化EcNOMVs,用激光纳米颗粒分析仪分析其粒径大小及分布,透射电子显微镜观察其形态结构;利用激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞对EcNOMVs的内在化;用玻璃珠涂板法测定巨噬细胞吞噬病原性大肠杆菌的数量以探究EcNOMVs对巨噬细胞杀菌能力的影响。然后分别用PBS（对照组）、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL和20μg/mL EcNOMVs刺激RAW264.7...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
EcN的表性特征示意图(Mohamedetal.,2010)
图 1-2 OMVs 的形成模型示意图 (Mashburn-Warren and Whiteley, 2006)Fig 1-2 The biogenesis of OMVs1.3.2 细菌胞外囊泡负载的分子胞外囊泡作为一种生物间通讯的载体分子，向胞外分泌时能够携带 LPS、蛋白质、脂质、核酸和其他毒力因子。在早期的报道中，通过生化分析包括聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹技术能够发现胞外囊泡携带的外膜蛋白（OmpA、OmpC and OmpF）、周质蛋白（碱性磷酸酶和 AcrA）和毒力因子（粘附素、侵袭素和其他酶类）(Lee eal., 2008)。了解这些蛋白质的功能，将有助于阐明 OMVs 的形成机制和生物功能。在过去的几年里，基于质谱分析的蛋白组学研究已经能够发现 3500 多种囊泡蛋白(Kimet al., 2013)。Evpedia 是一个收列了胞外囊泡相关性文章和囊泡蛋白高通量数据的网站(Kim et al.,2013 )。此网站提供了完整的生物信息分析工具（搜索和浏览囊泡成分、基因本体富集分析、囊泡蛋白和 mRNA 的网络分析、囊泡数据集的同源性鉴定比较），以系统分析真核和原核生物胞外囊泡负载的分子组成，进而阐明这些复杂细胞外囊泡的新功能。除了蛋白质，胞外囊泡中还存在较丰富的脂质。虽然脂类是革兰氏阴性菌胞外囊
图 2-1 EcN_OMVs 的分离Fig 2-1 Isolation of EcN_OMVsA：超速离心获得 OMVs；B：激光纳米颗粒分析仪检测 EcN_OMVs 粒径分布。A: OMVs precipitation was obtained by ultracentrifugation; B: Size distribution of EcN_OMVsas determined by nanoparticle tracking analysis. EcN_OMVs 的纯化获得高纯度的 EcN_OMVs，对超速离心得到的 OMVs 进行密度梯度离心，得到密度层的 OMVs，分别测定这 11 个密度层 EcN_OMVs 的浓度和粒径大小（表 2-1）。层的 OMVs 的浓度及粒径大小存在差异，其中，浓度最高的是第 5 层，为 2.26×/mL，对应的峰值为 115.0 nm。计算各层 EcN_OMVs 相对丰度，结果（图 2-2示 EcN_OMVs 浓度峰值在 F 5，为了满足试验需求，选择 F 4-F 6（浓度梯度在30%）的密度层再次进行超速离心富集得到纯化的 EcN_OMVs。激光纳米颗粒检测纯化后的 EcN_OMVs 如图 2-2 B 所示，分布图线条平滑，且只有一个峰值，1.5 nm，表明获得粒径较均一的高纯度 OMVs。表 2-1 密度梯度离心后各层 EcN_OMVs 浓度及粒径大小ble 2-1 Concentration and size of EcN_OMVs of each layer after density gradient centrifugation
【参考文献】：
期刊论文
[1]细菌鞭毛运动、黏附和免疫逃逸机制的研究进展[J]. 许绵,周明旭,朱国强. 中国兽医学报. 2017(02)
[2]植物应答非生物胁迫的蛋白质组学研究进展[J]. 付晨熙,肖自华,高飞,周宜君. 基因组学与应用生物学. 2016(12)
[3]口服益生菌Escherichia coli Nissle 1917调控断奶仔猪空肠黏膜屏障功能的机理研究[J]. 唐志如,邓欢,孙卫忠,张小龙,张翥. 畜牧兽医学报. 2014(01)
本文编号：3602585
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
EcN的表性特征示意图(Mohamedetal.,2010)
图 1-2 OMVs 的形成模型示意图 (Mashburn-Warren and Whiteley, 2006)Fig 1-2 The biogenesis of OMVs1.3.2 细菌胞外囊泡负载的分子胞外囊泡作为一种生物间通讯的载体分子，向胞外分泌时能够携带 LPS、蛋白质、脂质、核酸和其他毒力因子。在早期的报道中，通过生化分析包括聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹技术能够发现胞外囊泡携带的外膜蛋白（OmpA、OmpC and OmpF）、周质蛋白（碱性磷酸酶和 AcrA）和毒力因子（粘附素、侵袭素和其他酶类）(Lee eal., 2008)。了解这些蛋白质的功能，将有助于阐明 OMVs 的形成机制和生物功能。在过去的几年里，基于质谱分析的蛋白组学研究已经能够发现 3500 多种囊泡蛋白(Kimet al., 2013)。Evpedia 是一个收列了胞外囊泡相关性文章和囊泡蛋白高通量数据的网站(Kim et al.,2013 )。此网站提供了完整的生物信息分析工具（搜索和浏览囊泡成分、基因本体富集分析、囊泡蛋白和 mRNA 的网络分析、囊泡数据集的同源性鉴定比较），以系统分析真核和原核生物胞外囊泡负载的分子组成，进而阐明这些复杂细胞外囊泡的新功能。除了蛋白质，胞外囊泡中还存在较丰富的脂质。虽然脂类是革兰氏阴性菌胞外囊
图 2-1 EcN_OMVs 的分离Fig 2-1 Isolation of EcN_OMVsA：超速离心获得 OMVs；B：激光纳米颗粒分析仪检测 EcN_OMVs 粒径分布。A: OMVs precipitation was obtained by ultracentrifugation; B: Size distribution of EcN_OMVsas determined by nanoparticle tracking analysis. EcN_OMVs 的纯化获得高纯度的 EcN_OMVs，对超速离心得到的 OMVs 进行密度梯度离心，得到密度层的 OMVs，分别测定这 11 个密度层 EcN_OMVs 的浓度和粒径大小（表 2-1）。层的 OMVs 的浓度及粒径大小存在差异，其中，浓度最高的是第 5 层，为 2.26×/mL，对应的峰值为 115.0 nm。计算各层 EcN_OMVs 相对丰度，结果（图 2-2示 EcN_OMVs 浓度峰值在 F 5，为了满足试验需求，选择 F 4-F 6（浓度梯度在30%）的密度层再次进行超速离心富集得到纯化的 EcN_OMVs。激光纳米颗粒检测纯化后的 EcN_OMVs 如图 2-2 B 所示，分布图线条平滑，且只有一个峰值，1.5 nm，表明获得粒径较均一的高纯度 OMVs。表 2-1 密度梯度离心后各层 EcN_OMVs 浓度及粒径大小ble 2-1 Concentration and size of EcN_OMVs of each layer after density gradient centrifugation
【参考文献】：
期刊论文
[1]细菌鞭毛运动、黏附和免疫逃逸机制的研究进展[J]. 许绵,周明旭,朱国强. 中国兽医学报. 2017(02)
[2]植物应答非生物胁迫的蛋白质组学研究进展[J]. 付晨熙,肖自华,高飞,周宜君. 基因组学与应用生物学. 2016(12)
[3]口服益生菌Escherichia coli Nissle 1917调控断奶仔猪空肠黏膜屏障功能的机理研究[J]. 唐志如,邓欢,孙卫忠,张小龙,张翥. 畜牧兽医学报. 2014(01)
本文编号：3602585
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