利用CRISPR/Cpf1系统构建DDX21基因敲除模型及功能初步研究
发布时间：2022-01-23 01:04
CRISPR/Cpf1是2015年张峰小组报道的新型CRISPR系统,研究证实该系统具有更简单、更精准实现基因组编辑的潜能。解旋酶DDX21不仅能够参与信使RNA（Messenger RNA,mRNA）前体加工、RNA的转运和降解、核糖体的生成等多种生物学过程,而且在禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）、登革热病毒（Dengue virus,DENV）、人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）等病毒的增殖及信号传导过程中也发挥了重要作用。本研究首先利用CRISPR/Cpf1技术敲除哺乳动物HEK293细胞DDX21基因并感染H9N2亚型AIV,在细胞水平验证了CRISPR/Cpf1系统的活性及DDX21介导AIV感染的天然免疫应答机制;进一步探索了CRISPR/Cpf1慢病毒系统在鸡DF-1细胞和鸡体上的基因编辑,为揭示DDX21基因功能、病毒致病机制研究奠定了基础。CRISPR/Cpf1系统编辑哺乳动物细胞:以DDX21为靶向基因,利用在线软件chopchop筛选靶位点,分别构建pU6-Lb-crRNA-DDX2...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR/Cas系统的组成及分类Fig.1.1ThecompositionandclassificationofCRISPR/Cassystem图A为1类CRISPR/Cas系统（Makarovaetal.,2017）;图B为2类CRISPR/Cas系统（Makarovaetal.,2017b）
学院硕士学位论文 第一ISPR/Cas 系统作用机制同类型的 CRISPR/Cas 系统在发挥功能时所涉及的 Cas 蛋白的种类和数目不的 CRISPR 系统，其抵御外来遗传物质入侵的免疫防御过程都可分为 3 个阶段nd Wiedenheft, 2015）：外源 DNA 获取 当噬菌体和质粒 DNA 首次入侵时，Cas1 和 Cas2 形成蛋白列的紧邻基序(protospacer adjacent motif,PAM)，从外源 DNA 中获取序列原acer），插入到两段重复序列中形成新的间隔序列；crRNA 的加工 前导区激活 CRISPR 序列的转录，生成单链的前体 RNA(pre-酸酶和（或）Cas 蛋白进一步加工形成成熟的 crRNA；靶向干扰 当外源 DNA 再次进入宿主细菌时，成熟的 crRNA 与相应特异性，识别与 crRNA 互补的外源 DNA，引起 DNA 双链断裂（Double-strand break重组或非同源末端连接修复方式，造成靶基因的删除（knock out，KO）、敲入碱基或序列的突变，从而实现靶基因的精准修饰。
中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言（续表1-1）类型 CRISPR/Cas9 CRISPR/Cpf1Pre-crRNA加工方式 需要Cas9及RNAse III等加工成熟 由Cpf1加工成熟Guide RNA crRNA，tracrRNA crRNAPAM序列 G-rich，5'-NGG-3' T-rich，5'-KYIV-3'，5'-TTTN-3'DNA剪切复合体 Cas9-crRNA-tracrRNA(sgRNA-Cas9)核糖核蛋白复合体Cpf1-crRNA核糖核蛋白复合体DNA识别位点 前间隔序列5′端的PAM序列 前间隔序列3′端的PAM序列末端类型 平末端 粘性末端A B
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR技术:一个新型基因编辑工具所引发的革命[J]. 肖婧,张宗德. 华西医学. 2018(08)
[2]鸡OV启动子表达HA对禽流感病毒攻击提供完全保护[J]. 李亚芳,赵颖慧,刘赛宝,王伟,曾为俊,王金泉,陈洪岩,孟庆文. 中国生物工程杂志. 2018(07)
[3]猪DDX21基因的克隆、序列分析及原核表达[J]. 谢立兰,安康,陈力,孙紫德,方六荣. 华北农学报. 2017(03)
[4]CRISPR/Cas9介导CPED1基因敲除载体活性的验证[J]. 王飞,何娜娜,王颖洁,纪艳芹,张亚妮,李碧春. 中国家禽. 2017(07)
[5]鸡DMRT1基因CRISPR/Cas9载体构建及打靶效率的检测[J]. 杨秀荣,邓继贤,赵德彪,Mike McGrew,Sunil Nandi,蒋和生,Michael Clinton. 中国家禽. 2017(02)
[6]CRISPR/Cas9介导RB1基因敲除及其在鸡前脂肪细胞分化、增殖中的功能研究[J]. 张琦,黄娇娇,杨彩侠,王宇祥,张慧,赵建国,李辉. 畜牧兽医学报. 2016(09)
[7]CRISPR/Cas技术可有效介导家鸡基因敲除[J]. 左其生,王颖洁,赵瑞丰,程少泽,汪怡临,靳锴,王飞,纪艳芹,路镇宇,张文慧,张亚妮,李碧春. 畜牧兽医学报. 2016(06)
[8]CRISPR/Cas9系统在鸡MSTN上的效率验证[J]. 胡曼,康倩倩,胡晓湘,李宁. 中国家禽. 2016(07)
[9]慢病毒介导LOX-1基因RNA干扰抑制氧化应激诱导心肌细胞凋亡[J]. 刘彬,黄佳城,周迎春,孙学刚,曾文璧,李杏,臧书文,郝文文. 南方医科大学学报. 2012(02)
博士论文
[1]输卵管特异性表达人防御素4基因转基因鸡的制备[D]. 刘同欣.中国农业大学 2015
[2]基于慢病毒的输卵管特异表达人溶菌酶转基因鸡制备[D]. 曹代男.中国农业大学 2015
[3]慢病毒载体法高效转基因鸡制备技术研究[D]. 徐世永.南京农业大学 2007
硕士论文
[1]应用慢病毒介导生产转基因鸡的初步研究[D]. 陈忠毅.广西大学 2017
本文编号：3603274
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR/Cas系统的组成及分类Fig.1.1ThecompositionandclassificationofCRISPR/Cassystem图A为1类CRISPR/Cas系统（Makarovaetal.,2017）;图B为2类CRISPR/Cas系统（Makarovaetal.,2017b）
学院硕士学位论文 第一ISPR/Cas 系统作用机制同类型的 CRISPR/Cas 系统在发挥功能时所涉及的 Cas 蛋白的种类和数目不的 CRISPR 系统，其抵御外来遗传物质入侵的免疫防御过程都可分为 3 个阶段nd Wiedenheft, 2015）：外源 DNA 获取 当噬菌体和质粒 DNA 首次入侵时，Cas1 和 Cas2 形成蛋白列的紧邻基序(protospacer adjacent motif,PAM)，从外源 DNA 中获取序列原acer），插入到两段重复序列中形成新的间隔序列；crRNA 的加工 前导区激活 CRISPR 序列的转录，生成单链的前体 RNA(pre-酸酶和（或）Cas 蛋白进一步加工形成成熟的 crRNA；靶向干扰 当外源 DNA 再次进入宿主细菌时，成熟的 crRNA 与相应特异性，识别与 crRNA 互补的外源 DNA，引起 DNA 双链断裂（Double-strand break重组或非同源末端连接修复方式，造成靶基因的删除（knock out，KO）、敲入碱基或序列的突变，从而实现靶基因的精准修饰。
中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言（续表1-1）类型 CRISPR/Cas9 CRISPR/Cpf1Pre-crRNA加工方式 需要Cas9及RNAse III等加工成熟 由Cpf1加工成熟Guide RNA crRNA，tracrRNA crRNAPAM序列 G-rich，5'-NGG-3' T-rich，5'-KYIV-3'，5'-TTTN-3'DNA剪切复合体 Cas9-crRNA-tracrRNA(sgRNA-Cas9)核糖核蛋白复合体Cpf1-crRNA核糖核蛋白复合体DNA识别位点 前间隔序列5′端的PAM序列 前间隔序列3′端的PAM序列末端类型 平末端 粘性末端A B
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR技术:一个新型基因编辑工具所引发的革命[J]. 肖婧,张宗德. 华西医学. 2018(08)
[2]鸡OV启动子表达HA对禽流感病毒攻击提供完全保护[J]. 李亚芳,赵颖慧,刘赛宝,王伟,曾为俊,王金泉,陈洪岩,孟庆文. 中国生物工程杂志. 2018(07)
[3]猪DDX21基因的克隆、序列分析及原核表达[J]. 谢立兰,安康,陈力,孙紫德,方六荣. 华北农学报. 2017(03)
[4]CRISPR/Cas9介导CPED1基因敲除载体活性的验证[J]. 王飞,何娜娜,王颖洁,纪艳芹,张亚妮,李碧春. 中国家禽. 2017(07)
[5]鸡DMRT1基因CRISPR/Cas9载体构建及打靶效率的检测[J]. 杨秀荣,邓继贤,赵德彪,Mike McGrew,Sunil Nandi,蒋和生,Michael Clinton. 中国家禽. 2017(02)
[6]CRISPR/Cas9介导RB1基因敲除及其在鸡前脂肪细胞分化、增殖中的功能研究[J]. 张琦,黄娇娇,杨彩侠,王宇祥,张慧,赵建国,李辉. 畜牧兽医学报. 2016(09)
[7]CRISPR/Cas技术可有效介导家鸡基因敲除[J]. 左其生,王颖洁,赵瑞丰,程少泽,汪怡临,靳锴,王飞,纪艳芹,路镇宇,张文慧,张亚妮,李碧春. 畜牧兽医学报. 2016(06)
[8]CRISPR/Cas9系统在鸡MSTN上的效率验证[J]. 胡曼,康倩倩,胡晓湘,李宁. 中国家禽. 2016(07)
[9]慢病毒介导LOX-1基因RNA干扰抑制氧化应激诱导心肌细胞凋亡[J]. 刘彬,黄佳城,周迎春,孙学刚,曾文璧,李杏,臧书文,郝文文. 南方医科大学学报. 2012(02)
博士论文
[1]输卵管特异性表达人防御素4基因转基因鸡的制备[D]. 刘同欣.中国农业大学 2015
[2]基于慢病毒的输卵管特异表达人溶菌酶转基因鸡制备[D]. 曹代男.中国农业大学 2015
[3]慢病毒载体法高效转基因鸡制备技术研究[D]. 徐世永.南京农业大学 2007
硕士论文
[1]应用慢病毒介导生产转基因鸡的初步研究[D]. 陈忠毅.广西大学 2017
本文编号：3603274
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